ErbB-3结合蛋白Ebp1在肝细胞肝癌中上调表达的生物学意义研究

Ebpl是新发现的ErbB-3胞内结合蛋白，是增殖相关的PA2G4家族中的一员，PA2G4可编码两种Ebp1同种异构蛋白p42和p48，可抑制多种肿瘤细胞的增殖和诱导细胞分化，但肝癌中的作用尚未见报道。我们在前期研究中发现Ebp1在肝细胞肝癌（HCC）组织中高表达，因而设想Ebpl可能影响HCC的发生和进展。因此本课题首先利用免疫组化检测Ebp1、ErbB-2、ErbB-3等在肝癌组织中的表达，并分析Ebp1与肝癌临床病理参数之间的关系；其次，采用基因转染和siRNA技术，结合MTT法、克隆集落形成实验、细胞周期与凋亡检测等方法，探讨Ebpl在肝癌细胞生长增殖中的作用。在此研究基础上，进一步阐明Ebp1两个不同片段p48和p42对肝癌细胞生长增殖的影响及其分子机制。这将有效揭示Ebpl在肝癌中高表达的生物学意义以及肝癌的临床诊断、预后判定和基因治疗找出新的靶点提供科学依据。

Ebpl是新发现的ErbB-3胞内结合蛋白，是增殖相关的PA2G4家族中的一员，可抑制多种肿瘤细胞的增殖和诱导细胞分化，但肝癌中的作用尚未见报道。本课题（1）利用cDNA 基因芯片技术筛选肝癌组织中差异表达基因，结果发现 Ebp1是肝癌中过高表达的基因之一，利用Northern bloting技术进一步鉴定了Ebp1 基因mRNA在肝癌组织和不同肝癌细胞系中高表达，且均显示1.7Kb和2.2Kb两个条带，表明Ebp1基因表达与肝癌发生发展有关。（2）利用免疫组织化学方法观察肝癌组织芯片中ErbB2、ErbB和Ebp1蛋白的表达，并分析Ebp1与肝癌临床病理参数之间的关系，证实了Ebp1与ErbB3蛋白的表达具有正相关，并Ebp1蛋白阳性表达与HCC 患者HbsAg感染有关，但是与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度等临床病理因素无关。（3）构建了真核表达载体pEGFPC1-Ebp1，并通过脂质体转染法构建了稳定表达Ebp1蛋白的HepG2细胞和NIH3T3细胞。MTT法、克隆集落形成实验、细胞周期和凋亡检测等实验表明，Ebp1高表达促进肝癌细胞生长和增殖。（4）成功构建了Ebp1长片段p48，并激光共聚焦扫描显微镜观察Ebp1 p48编码蛋白表达，结果HepG2细胞和NIH 3T3细胞浆内可见大量GFP融合Ebp1蛋白的表达，而Ebp1短片段p42基因克隆未能成功。（5）ErbB3配体HRG促进稳定转染Ebp1 p48的HepG2细胞增殖和迁移，并磷酸化Akt的表达增多，表明ErbB3-Ebp1 p48长片段可能是新的肝癌侵袭转移相关信号通路，并且可能通过Akt信号通路。本研究证实了Ebp1是一种新的肝癌相关候选基因，并初步探讨了Ebp1 长片段p48在肝癌细胞生长增殖的影响，为进一步深入研究ErbB3-Ebp1通路在肝癌中的作用研究奠定了基础。