Ebp1长片段p48促进乙肝相关性肝癌细胞增殖和侵袭转移的分子机制研究

Our Previous study has demonstrated that Ebp1 was highly expressed in liver cancer tissues and cells, and the up-regulated p48 Ebp1 promote the proliferation and migration ability of HepG2 cells.Ebpl is a novel ErbB-3 binding protein which has two isoforms, p42 and p48. Hepatitis B virus X protein (HBx) is involved in growth and migration of hepatoma cells through Akt/mTOR signaling pathway. Furthermore, Our recent study shows that Ebp1 mRNA expression of p48 Ebp1 related to HBV infection, and the up-regulated p48 Ebp1 increases the proliferation of glioma cells by Akt phosphorylation. These results suggest that p48 Ebp1 might be involved Akt/mTOR signaling pathway mediated by HBx induced proliferation, invasion and metastasis of liver cancer. We will further evaluate the expression level of HBx and Ebp1 in the liver tissue and cells infected by HBV and investigate the relationship between HBx and Ebp1. In addition, we will determine the effects of HBx on the p48 Ebp1 mediated proliferation, invasion and metastasis of liver cancer cells by using p48 Ebp1 overexpression or knockdown hepatoma carcinoma cell. We will also study whether p48 Ebp1 is involved in HBx mediated Akt/mTOR signaling pathway.This study will reveal the role of p48 Ebp1 on the HBV induced liver cancer progression and metastasis, and provide potentail therapeutic target for hepatocellular carcinoma.

我们在前期研究证实，ErbB3胞内结合蛋白Ebpl在肝癌组织和细胞中高表达，其长片段p48促进肝癌细胞的增殖和迁移。Akt/mTOR信号途径在HBx蛋白促进肝癌细胞增殖和侵袭转移过程中起重要作用，而我们前期实验中发现，p48 Ebp1的mRNA表达量与HBV感染相关，且稳定转染p48 Ebp1可使肝癌细胞pAkt表达增多。由此我们推测p48 Ebp1可能是新的HBx相关蛋白，影响HBx介导的Akt/mTOR信号途径。本项目进一步检测HBV感染肝癌组织中HBx表达量和Ebp1的表达，探讨HBx表达量与Ebp1及p48 Ebp1是否存在相关性；观察p48 Ebp1高表达或沉默对HBx促进肝癌细胞增殖和侵袭转移的影响及Akt/mTOR信号途径级联信号分子的变化，旨在获得p48 Ebp1参与HBx调控Akt/mTOR信号途径的可靠证据。为丰富HBx在肝癌细胞增殖和侵袭转移中的作用机制提供新的靶点。

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是危害我国居民健康的主要恶性肿瘤之一，其恶性程度高，治疗效果不理想。我国被诊断的肝癌患者中乙肝相关性肝癌病人众多，因此针对性探讨乙肝病毒相关性HCC的发生发展机制具有重要意义。Ebp1是新发现的ErbB-3胞内结合蛋白，是增殖相关的PA2G4家族中的一员，可编码p42和p48 Ebp1两个同种异构蛋白，其中p48主要位于细胞质和核内，过度表达抑制细胞凋亡。mTOR是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞生长、增殖、分化及细胞周期的调控等，且Akt/mTOR信号途径在HBx蛋白促进肝癌细胞增殖和侵袭转移过程中起重要作用。本研究1）采用生物信息学技术结合分子生物学方法，分析了Ebp1在肝癌中的表达与p53和乙肝病毒感染关系，结果显示肝癌组织中Ebp1的表达率明显高于癌旁组织，Ebp1表达与HBV感染有关，且P53的表达呈正相关。2）建立沉默Ebp1的HepG2.2.15肝癌细胞系，进行细胞生物功能检测。结果显示沉默Ebp1的肝癌HepG2.2.15细胞增殖率明显低于对照组；流式细胞仪检测结果显示沉默Ebp1组保持活力的肝癌细胞数明显减少，G1期细胞数明显增加，而S期细胞数减少，提示抑制Ebp1的表达可引起细胞周期阻滞，Ebp1的表达促进肝癌细胞增殖活性；平板克隆实验检测结果显示与对照组相比沉默Ebp1组克隆集落形成明显减少；通过划痕实验观察沉默Ebp1组细胞增殖迁移能力明显低于对照组；Transwell侵袭实验观察结果显示沉默Ebp1组迁移到小室的细胞数明显少于对照组。3）利用PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin对高表达Ebp1的肝癌细胞均抑制细胞生长，且Western blot结果发现，AKT、mTOR的磷酸化分别被抑制，提示高表达Ebp1诱导PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，且这一过程促进了肝癌细胞的增殖。4）裸鼠构建肝癌皮下移植瘤模型实验结果表明，Ebp1沉默组较对照组的肿瘤生长缓慢，随着时间进展两组肿瘤体积出现显著差异，提示Ebp1可在体内促进肿瘤生长。总之，通过本研究证实了Ebp1高表达通过促进乙肝病毒相关肝癌细胞生长、增殖、迁移及改变细胞周期调控肝癌恶性生物学行为，其作用可能通过PI3K/Akt/mTOR信号途径促进肝癌进展。