核修饰基因PRICKLE3在Leber遗传性视神经病变中的机制研究

Leber’s hereditary optic neurophthy (LHON) is a maternally inherited eye disease. Three most common mutations are accounted for 90% LHON cases in some country and 50% in China. Since LHON is notable for its incomplete penetrance and man bias, an agreement that X-chromosomal gene (located on the area Xp21.1-q21.2 or Xq25-27.2) affecting the phenotypic expression was postulated in several studies and failed to be identified to date. On the basis of our recent study in a LHON pedigree by the whole-exome sequencing, we found an X-linked gene PRICKLE3 on Xp11.23 with homozygous missense mutation in a Mendel fashion. Here, we would set out to prove that PRICKLE3 is a novel gene conferred the risk of LHON by experiments in vivo and in vitro: 1) the role of PRICKLE3 in mitochondrial morphology and function; 2) the molecular mechanism of PRICKLE3 to aggravate the mitochondrial dysfunction; 3) The function of Prickle3 in RGCs and retinas from the wild-type and Prickle3-/- or Prickle3 (157C>T) mice. This study may not only provide new insights into the pathogenesis of LHON but also inspire us to well understand the complex phenotype of LHON attributed to the interaction of genes between nucleus and mitochondria, which in turn paving the way for future basic research and therapeutic interventions.

Leber遗传性视神经病变（LHON）是典型的母系遗传疾病。三个线粒体原发性突变是其发病的主要分子基础，但它表型的复杂性提示核基因参与LHON致病。尤其是LHON男性多发，预测X染色体上有调控LHON的核基因，但具体基因未见报导。我们已通过遗传家系的全外显子测序与分析，发现PRICKLE3基因与LHON致病相关。本项目拟在此研究基础上，以细胞和小鼠模型为材料，诠释PRICKLE3在LHON致病中的机制：1) 揭示PRICKLE3突变对细胞线粒体形态与功能的影响； 2) 探究PRICKLE3调控线粒体功能的分子机制；3)阐明Prickle3在小鼠视神经节细胞和视网膜中的作用机制。本项目的实施不仅有助于诠释LHON致病机制，丰富核基因与线粒体基因的互作机理，也将为临床转化提供科学依据。

Leber遗传性视神经病变（LHON）是典型的母系遗传疾病。LHON的男性多发，预测X染色体上有调控LHON的核基因，但未见报导。前期通过遗传家系的全外显子测序与分析，在多个携带m.11778G>A的LHON家系中发现X-连锁基因PRICKLE3（c.157C>T,p.Arg53Trp）。本项目在此基础上，诠释了PRICKLE3在LHON中的致病机制：1) 证明PRICKLE3是线粒体蛋白，突变影响其蛋白稳定性，但并不影响它在线粒体上的定位与分布。2) 揭示PRICKLE3突变影响细胞线粒体形态和功能。突变协同m.11778G>A使线粒体功能异常，如呼吸链功能下降，ATP产能下降，ROS增高等；双突变的线粒体更趋于破碎化。但通过呼吸链复合物的酶活分析发现PRICKLE3主要影响线粒体复合物V(ATPase)的活性。3)PRICKLE3通过与ATP8相互作用影响ATPase稳定性。通过体外敲低细胞和病人来源细胞的蛋白实验，我们发现PRICKLE3突变主要降低ATP6，ATP8等部分ATPase亚基蛋白水平。体外BN-PAGE实验分析发现PRICKLE3突变显著下降ATPase稳定性，过表达PRICKLE3能显著重塑ATPase稳定性。体外免疫共沉淀实验证明PRICKLE3与ATPase亚基ATP8存在相互作用。4）通过构建Prickle3-KO小鼠，证明Prickle3缺失同样导致小鼠视神经节细胞（RGC）的线粒体功能下降，ATPase酶活和稳定性下降，亚基ATP6和ATP8蛋白水平降低。RGC中线粒体出现空泡。5）Prickle3-KO小鼠视网膜表现出LHON病人病理特征。Prickle3缺陷小鼠RGC细胞凋亡，数目下降，神经突触减少；Prickle3缺陷小鼠视网膜血管弯曲扩张，视网膜功能下降。本项目阐释了PRICKLE3协同线粒体突变影响LHON外显的分子机制，丰富了核基因与线粒体基因互作的致病机理。. 项目同时发现视神经萎缩的一些特殊病例：1）发现多个DOA家系携带OPA1新突变，其中对新剪切突变c.1444-2A>C进行了功能验证，证明剪切突变导致第15个外显子缺失，并体现单倍剂量不足效应。2）发现线粒体异质突变m.14459G>A至LHON发病等。. 项目已发表论文4篇，正在修订1篇，另撰写1篇; 发表LHON临床实验指南1篇，授权专利1项。