组织工程化iPS细胞联合激活态雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究

Spinal cord injury (SCI) is a sophistic problem that confused researchers for many years. So many studies focused on improving regeneration of neurons by way of transplanting all kinds of stem cells. Creating of induced pluripotent stem (iPS) cells is a break-stone in the development of biomedicine. This throws doubt on the traditional ideas about cultivation and differentiation of stem cells. Our previous studies have found that iPS cells reprogrammed from human umbilical cord blood cells could differentiate into neuronal cells by the effect of activated Schwann cells (ASCs). These iPS cells can stay alive, differentiate into neuronal cells, ameliorate the microenvironment and improve the functions after being transplanted in the injured spinal cord. Based on the above findings, we are planning to culture partly differentiated iPS cells and SCSs on PLGA scaffolds. The status of differentiation and interaction will be observed. Then, these bio-engineering scaffolds will be transplanted into the sub-acute injured rat's spinal cord. Final effects are evaluated by way of RT-PCR and Western-Blot analysis, immunofluorescence staining, BDA tracing, MEP&SEP, BBB scoring. By this way, we'd like to find an effective method to treat the SCI patients.

脊髓损伤（SCI）一直是困扰医学界的一大难题。干细胞移植促进SCI后神经修复是目前研究的重点和热点。诱导型多能干细胞（iPS）的发现打破了此前关于干细胞分化和培养的传统观点。本课题组前期的研究发现，人脐血源性iPS细胞在激活态雪旺细胞（ASCs）分泌的神经营养因子诱导下可以向神经方向分化；将其移植入SCI部位后能够在一定程度上改善局部微环境、向神经方向分化从而促进脊髓损伤后轴突再生及神经功能恢复。本研究拟在此基础上，将诱导培养后的iPS细胞作为种子细胞，并采用前期制备的PLGA作为组织工程支架，将iPS细胞与ASCs进行联合培养，观察其组织相容性；并建立亚急性SCI动物模型，将组织工程化iPS细胞及ASCs移植入SCI实验动物体内。通过RT-PCR、Western-Blot、免疫荧光染色、神经电生理及肢体功能评分等方法探讨其修复脊髓损伤的有效性，以期对临床治疗脊髓损伤提供新思路和理论依据。

脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）的治疗一直困扰着医学界。人们在干细胞和组织工程细胞移植方面进行了大量研究，但无突破性进展。近几年，研究侧重点由移植后肢体功能、修复效果评价逐渐转向对脊髓损伤后病理生理机制、分子生物学机制的探讨。本项目采用组织工程化iPS源性神经干细胞（iPS derived Neural Stem Cells，iPS-NSCs）联合激活态雪旺细胞（Activated Schwann cells，ASCs）移植修复脊髓损伤，同时在原研究基础上，对激活态雪旺细胞和正常态雪旺细胞的DNA甲基化差异方面进行了研究,结果发现激活态的雪旺细胞和正常态的雪旺细胞的甲基化水平存在214个轴突再生相关甲基化差异基因，并且涉及轴突生长、轴突形成、轴突延伸以及轴突导向等主要生物过程和MAPK细胞信号通路、细胞黏附分子通路以及Ras细胞信号通路等主要通路，同时发现iPS-NSCs、ASCs共培养体系在组织工程支架上能够形成3D培养，iPS-NSCs能够分化为神经元，且多分布于表达MBP的ASCs周围，组织工程支架能够作为细胞载体进行体内移植。ASCs能够在组织工程支架上形成一个滋养层，为iPS-NSCs的生长提供一个良好的环境，并且iPS-NSCs来源的神经元多分布于表达MBP的ASCs周围，提示ASCs能够为神经元提供髓鞘的支持，组织工程支架支架与NSCs、ASCs共培养系统具有良好的生物相容性。本研究最终通过将组织工程化的iPS-NSCs与ASCs局部移植入大鼠脊髓损伤部位，采用RT-PCR（Real time-PCR）、Western-blot方法检测移植治疗后损伤部位局部抑制性因子以及相关神经营养因子表达水平变化，TUNEL染色观察脊髓损伤局部细胞凋亡情况，并在不同时间点进行肢体功能BBB评分综合评价了组织工程化iPS-NSCs联合ASCs移植修复脊髓损伤的效果，结果发现不同时间NF及MBP表达量比较两组均有统计学差异（P<0.01），NF及MBP表达量各组均有升高，但以联合移植组最高，空白对照组最差，GFAP表达量在空白对照组随时间升高明显（P<0.05），而在联合移植组各时间表达量无明显变化（P>0.05），这为临床脊髓损伤的治疗提供了新策略。