人脐血干细胞诱导iPS细胞移植修复脊髓损伤的研究

脊髓损伤（SCI）一直是困扰医学界的一大难题。干细胞移植促进SCI后神经修复是目前研究的重点，但仍在不断寻找"理想的种子细胞"。而诱导型多能干细胞（iPS）的发现打破了此前关于干细胞分化和培养的传统观点，成为生物医学发展史上的里程碑。本课题组已有的研究发现，人脐血干细胞（HUCBCs）移植入SCI部位后，能在一定程度上改善局部微环境、向神经细胞方向分化从而促进脊髓损伤后轴突再生及神经功能恢复。本研究拟在此基础上，通过体外分离培养HUCBCs，并进行特定的基因转染和细胞基因的重编程而获得iPS细胞。并建立亚急性SCI实验动物模型，将荧光素酶标记后的HUCBCs及iPS细胞移植入脊髓损伤大鼠体内。通过生物发光活体显像、RT-PCR、Western-Blot、免疫荧光染色、BDA神经示踪、神经电生理及肢体供能评分等方法从不同角度探讨其修复脊髓损伤的有效性，为临床治疗脊髓损伤提供可行方法及依据。

脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）病理生理机制复杂。干细胞移植促进SCI后神经修复是目前研究的重点，但仍在不断寻找"理想的种子细胞"。而诱导型多能干细胞（induced Pluripotent Stem cells,iPS）的发现打破了此前关于干细胞分化和培养的传统观点，成为生物医学发展史上的里程碑。本课题组已有的研究发现，人脐血干细胞（HUCBCs）移植入SCI部位后，能在一定程度上改善局部微环境、促进脊髓损伤后轴突再生及神经功能恢复。本研究在此基础上，通过体外分离培养HUCBCs，并进行特定的基因转染和细胞基因的重编程而获得iPS细胞。在体外培养、扩增后进行形态学、碱性磷酸酶以及免疫荧光鉴定。结扎成年Wistar大鼠双侧隐神经近端，一周后取下结扎处远端的隐神经，采用双酶消化组织块法结合机械分离法分离培养ASCs；采用ASCs培养基半量换液法及体内共移植诱导iPS细胞向神经方向分化，应用免疫组化、Western-Bolt半定量、Real-time PCR（NF200、GFAP、MBP）定量分析等方法在诱导培养后1、2、3、4周综合评价诱导分化情况，分析其神经标志性蛋白的表达情况。同时，制作成年雌性Wistar大鼠胸10脊髓损伤模型，并将iPS细胞移植入脊髓损伤部位。术后采用BBB评分对大鼠的后肢功能恢复情况进行评价。8周后，从每组随机选取8只大鼠进行10％BDA顺行示踪标记。标记两周后处死动物，将损伤段脊髓取出作5μm快速冰冻切片后，进行BDA显影、HE染色，NF200、GFAP、MBP免疫组化染色及轴突染色。结果发现ASCs可以分泌多种神经营养因子并促进iPS细胞在体外及Wistar大鼠体内的增值和向神经源性细胞分化。动物实验结果显示iPS细胞移植后在脊髓损伤区域可以向神经元和少突胶质细胞分化，填充组织缺损，弥补脊髓空洞，有利于神经再生轴突的延伸和突触之间的连接，促进轴突再生，改善脊髓损伤后功能的恢复。