蛋白诱导iPS复合明胶/PLGA核壳型管状支架构建组织工程化脊髓及修复脊髓损伤的实验研究

脊髓横断损伤后，轴突不能有效通过瘢痕界面生长已经成为制约脊髓损伤治疗的关键问题。我们的前期实验证实应用组织工程技术构建的神经支架有利于轴突通过界面生长。诱导多能干细胞(iPS)具有多向分化潜能、无免疫原性、来源广泛、不涉及伦理问题等优点。本研究在已成功构建立人、大鼠、小鼠iPS的基础上，拟首次采用安全性更高的蛋白诱导技术产生iPS细胞、进而将其定向分化为神经干细胞作为脊髓损伤的优化种子细胞；制备具有自主专利、利于神经细胞生长与轴突延长的明胶/PLGA核壳型支架，体外研究该支架对iPS诱导分化的神经干细胞(iPS-NSC)黏附、增殖、分化等生物学行为的影响；并将iPS-NSC复合明胶/PLGA支架植入脊髓损伤动物模型，检测该组织工程化脊髓能否有效促进轴突的再生、延长和通过瘢痕界面，而形成有功能性的神经连接和环路，达到部分修复和重建脊髓的目的；以期为组织工程化脊髓的临床应用提供一全新策略。

本课题成功构建pCMV-9R-Sox2,Oct4,c-Myc,Klf4四种精氨酸穿膜肽质粒，经活性蛋白裂解液复合反复冻融法处理细胞后得到穿膜蛋白。将此蛋白反复转导小鼠成纤维细胞（MEF），GFP对照可见胞内有荧光表达，表明穿膜蛋白可进入细胞内，但后续实验未成功诱导出iPS。改用电穿孔法质粒（pEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-miR302 cluster）非整合技术后，成功将小鼠MEF细胞诱导成为iPS细胞，进一步将其定向分化为神经干细胞(iPS-NSC)，并通过光镜下形态观察、免疫荧光检测细胞特异性标志物Nestin,Pax6,MAP-2,GFAP及膜片钳检测细胞动作电位发放予以鉴定，可为后续修复脊髓损伤提供种子细胞；因聚乙二醇（PEG）与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA）共混后有更好的亲水性，材料表面也因更加粗糙易于细胞粘附，故本课题组利用静电纺丝技术方便、经济、高效的制备了电纺PLGA/PEG材料，并对其进行了iPS-NSC细胞生物相容性验证，结果显示优化后的PLGA/PEG纳米纤维材料组与对照组相比无明显细胞毒性，并可显著提高细胞粘附率，促进细胞增殖及分化；利用扫描电镜观察细胞在支架上粘附生长，结果显示PLGA/PEG支架上细胞数量较对照组明显增多，两组中分化的神经元细胞轴突均延展好，突触相互接触紧密；将明胶海绵修剪成直径、厚度合适的圆柱状，填塞入PLGA/PEG外壳中，构建成明胶-电纺PLGA/PEG核壳型管状支架；为了方便、有效的重复，本研究建立了大鼠T10节段脊髓全横断损伤模型，将预先使用GFP标记的iPS-NSC复合支架构成的组织工程化脊髓植入动物模型中，术后2周处死部分动物，取出大体脊髓观察及HE染色，可见材料组与对照组相比具有更少的瘢痕形成，进一步的组织免疫荧光鉴定显示术后2周植入PLGA/PEG组织工程支架组的脊髓组织中有大量GFP标记的MAP-2阳性细胞出现。在脊髓正常节段，仍可见到GFP标记的分化神经元，表明移植细胞发生迁移。术后BBB形态学评分可见移植材料组大鼠神经功能的恢复优于对照组，表明上述iPS-NSC-明胶-电纺PLGA/PEG组织工程化脊髓能够有效的促进轴突的再生并通过瘢痕界面，从而形成有功能性的神经连接和环路，达到部分修复脊髓损伤的作用，可为组织工程化脊髓的临床应用提供一全新策略。