表达产肠毒素大肠杆菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒疫苗的构建及免疫学评价

本项目拟通过将产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素（STa）和黏附素K99基因融合构建STa-K99腺病毒载体，最终制备能表达产肠毒素大肠杆菌（ETEC）耐热性肠毒素和黏附素STa-K99融合抗原蛋白的重组腺病毒双价基因疫苗。首先通过体外、体内试验对腺病毒表达STa-K99融合蛋白的免疫原性和安全性进行分析。在此基础上，通过动物免疫试验对重组腺病毒载体疫苗经不同免疫途径（皮下注射、肌肉注射和灌胃）和免疫剂量免疫后机体产生的免疫应答进行研究，揭示重组STa-K99腺病毒载体疫苗诱发体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫的免疫应答机制，为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定基础。同时，也为利用重组腺病毒载体研制其它重大动物肠道传染病疫苗提供理论依据。

本项目按照研究计划，完成了研究任务。主要研究内容及研究结果如下：.克隆了产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素（STa）和黏附素K99基因，将二者进行了融合，构建了表达该融合基因的原核表达载体，并对融合蛋白进行了表达纯化。同时，通过将Sta-K99融合基因与腺病毒穿梭质粒重组构建了重组穿梭质粒，采用PacⅠ酶切将其线性化后回收纯化，将腺病毒基因组骨架质粒pAdgenome同样采用PacⅠ酶切线性化后透析法回收，将二者共转染293细胞，采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒，采用PCR法和Western blotting对重组腺病毒进行鉴定，在此基础上，通过动物试验对表达STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫原性和安全性进行分析。取得了以下研究结果：（1）成功构建了能表达产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素和黏附素STa-K99融合抗原蛋白的重组腺病毒载体，病毒的病毒滴度 T=1010.6 PFU/mL；（2）构建的重组STa-K99腺病毒载体疫苗能够诱发机体产生较高水平的体液免疫：与对照组相比，重组腺病毒免疫组小鼠在免疫后7d的特异性IgG抗体水平显著升高（p<0.05），在35d达到最大值，与对照组达到极显著差异（p<0.01），直至42d均保持在较高水平；（3）免疫小鼠2周后，Ad.STa-K99免疫组小鼠的脾脏淋巴细胞的增殖活性显著增强，血清中IL-2和IFN-γ含量均明显高于Ad.Blank组及PBS组(p＜0.01)，而这二种细胞因子可以有效促进B淋巴细胞的成熟和分化，促进抗体分泌以及增强巨噬细胞的吞噬活性；（4）构建的重组STa-K99腺病毒载体疫苗能够诱发机体产生较高水平的局部黏膜免疫反应：免疫后7d开始，Ad.STa-K99组sIgA抗体水平明显升高，直至42d均保持在较高水平，且与对照组达到极显著差异；（5）构建的重组STa-K99腺病毒载体疫苗对小鼠的免疫保护率达到了70%。. 研究结果为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定基础。通过本项目的实施，共发表论文6篇，其中SCI收录2篇，核心期刊4篇。培养硕士研究生3名，已毕业2人，在读1人；在本基金项目的资助下，项目组成员先后参加了2011年和2012年中国微生物学会学术年会，项目负责人邓光存应邀参加了2013年第十六届国际动物卫生大会，并作了分会场报告。