表达牛结核分枝杆菌主要免疫优势抗原重组腺病毒载体的构建及其免疫学评价

本研究拟利用人型5型腺病毒作为载体，表达牛结核分枝杆菌多个免疫优势抗原（ESAT-6、CFP-10、Ag85A和Ag85B）的融合蛋白，并将大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的无毒性突变体基因与其融合，作为分子内佐剂共表达，构建两种重组腺病毒载体；对重组腺病毒载体进行筛选、纯化、和安全性检测；在此基础上，以小鼠为实验动物，通过检测机体CD4+、CD8+T细胞、INF-γ、Th1细胞因子、血清抗体和呼吸道黏膜SIgA等免疫学指标，探讨这二种重组腺病毒经不同免疫途径（皮下注射、肌肉注射和呼吸道黏膜感染）刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和局部黏膜免疫的免疫学特性；并通过动物保护试验验证其免疫保护效果，综合评价表达牛结核分枝杆菌主要免疫优势抗原的重组腺病毒在牛结核病免疫预防中的潜在应用价值，为牛结核病新型疫苗的研究提供理论依据。

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的慢性致死性人兽共患性传染病。本研究围绕牛结核病新型重组腺病毒载体疫苗、病原菌-宿主细胞相互作用及其机制等牛结核病免疫防控和机体免疫应答中的基础科学问题，采用人5型腺病毒构建了共表达牛分枝杆菌免疫优势抗原蛋白CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B的重组腺病毒载体Ad5-CEAB；通过小鼠模型对Ad5-CEAB的免疫原性进行了综合评价，并对不同的免疫策略进行了研究；探讨了Wnt/β-catenin信号在肺泡巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染过程中的免疫调节作用及其机制；miR-124在肺泡巨噬细胞和肺脏上皮细胞抗结核分枝杆菌感染过程中的免疫调节作用及其机制。取得了以下主要研究结果：（1）构建了CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B基因的真核共表达载体，制备并纯化获得了高纯度的CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原；（2）成功构建了可以同时表达4种牛分支杆菌免疫优势抗原基因的重组腺病毒Ad5-CEAB；（3）以小鼠为动物模型对Ad5-CEAB的免疫原性进行了评价，结果表明，Ad5-CEAB能够刺激小鼠产生较高水平的呼吸道黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，表明构建的重组腺病毒Ad5-CEAB有望发展为一种新型的抗牛结核病疫苗；（4）采用BCG初免—Ad5-CEAB加强的免疫策略，证实BCG初免—Ad5-CEAB加强的免疫效果优于BCG单独免疫，表明Ad5-CEAB是一种有效的免疫加强侯选疫苗；（5）Wnt/β-catenin信号通过抑制巨噬细胞过度分泌炎性因子TNF-α和IL-6，并上调抑炎因子IL-10的表达水平发挥其对BCG感染后巨噬细胞炎性反应的负调控作用；Wnt/β-catenin信号通过上调BCG感染后巨噬细胞的促凋亡蛋白Bax的表达水平、下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达水平，并启动主要依赖于caspase途径的凋亡程序；（6）Wnt/β-catenin信号能通过降低BCG感染后巨噬细胞的ROS水平，同时下调坏死相关蛋白PARP-1和AIF的蛋白表达量，从而阻止巨噬细胞的坏死；(7) BCG感染RAW264.7细胞和A549细胞后，过表达和RNA干扰MyD88表达可分别提高和降低细胞内miR-124转录水平。提示在抗结核分枝杆菌感染中，肺泡上皮细胞和巨噬细胞中的miR-124和TLR信号可形成一个负反馈调控环。