牛瑟氏泰勒虫P23-P33基因真核表达载体和重组腺病毒载体的构建及免疫学评价

牛瑟氏泰勒虫病是危害养牛业生产的重要寄生虫病之一，但至今尚无有效的治疗药物和疫苗，严重阻碍了牛瑟氏泰勒虫病的防控。因此，本研究拟从牛瑟氏泰勒虫具有免疫保护性的P23、P33表面蛋白基因入手，拼接P23和P33基因；构建真核表达载体和重组腺病毒载体，制备牛瑟氏泰勒虫P23-P33基因DNA疫苗和重组腺病毒载体疫苗，分别免疫实验动物，测定动物机体的细胞免疫水平和体液免疫水平，并进行攻虫试验，评价两种疫苗的免疫保护作用。之后采用prime-boost免疫策略接种实验动物，评价prime-boost免疫策略的效果，以期为牛瑟氏泰勒虫病的防制奠定基础。

为验证牛瑟氏泰勒虫DNA疫苗和重组腺病毒疫苗的prime-boost免疫策略对实验动物的免疫保护作用，项目组圆满完成了6项计划研究内容，并进行了拓展研究。本项目应用SOE-PCR技术拼接牛瑟氏泰勒虫P23和P33表面蛋白基因，获得1151 bp的P23-P33双基因融合片段；构建了牛瑟氏泰勒虫真核表达重组质粒pVAX-P23-P33，并在HeLa细胞中获得瞬时表达；制备了pVAX-P23-P33 DNA疫苗，该DNA疫苗能够提高接种BABL/C小鼠的细胞免疫水平和体液免疫水平，并对BABL/c小鼠具有一定的免疫保护作用；成功构建了牛瑟氏泰勒虫Ad-P23-P33重组腺病毒，该病毒滴度为10^8 IU/mL，重组腺病毒Ad-P23-P33接种BABL/c小鼠后，在抗体水平和细胞因子IFN-γ、IL-4水平上，与pVAX-P23-P33组和PBS组比较，差异均极显著（P<0.01），Ad-P23-P33对攻虫BABL/c小鼠具有60%的免疫保护率；DNA疫苗-重组腺病毒疫苗的prime-boost免疫策略能够显著提高BABL/c小鼠的细胞免疫水平和体液免疫水平，对攻虫BABL/c小鼠具有70%的免疫保护率。同时，对牛瑟氏泰勒虫P23-P33基因进行了原核表达；构建了牛瑟氏泰勒虫P33基因重组腺病毒穿梭载体pCR259-P33和重组腺病毒载体Ad-P33；对牛瑟氏泰勒虫MPSP双表位基因进行了拼接与克隆、原核与真核表达，对牛瑟氏泰勒虫吉林株ITS基因进行了系统进化分析；建立了牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因LAMP检测方法、MPSP基因二温式PCR检测方法及ITS基因PCR检测方法；对牛瑟氏泰勒虫表面蛋白P23和P33基因、HSP70基因及18S rRNA基因的PCR方法进行了比较，并应用筛选的PCR方法对延边地区及吉林省的牛瑟氏泰勒虫病进行了分子流行病学调查。本项目为牛瑟氏泰勒虫病的防制和深入研究奠定了基础。