YMO1抑制肝细胞癌复发转移的新功能与作用机制研究

To clarify the molecular mechanism of liver cancer invasion and metastasis is the key to prevention and treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) recurrence and metastasis. Our previous study found that the level of expression of YMO1 was significantly low in HCC tissues and cell lines, and its expression is closely correlated with vascular invasion, overall survival and disease-free survival of HCC patients. Moreover, overexpression of YMO1 inhibited invasion and metastasis ability of HCC cell lines. Here we speculated that YMO1 plays a pivotal role in the regulation of invasion and metastasis in HCC. Therefore, firstly, this study intends to use plasmid transfection and biophotonic imaging technology to investigate the nude mouse orthotopic liver tumor model and Ymo1 gene-knockout mouse to further verify the role of YMO1 inhibiting liver cancer invasion and metastasis. Secondly, with the use of protein-chip technology, and literature analysis, by co-immunoprecipitation screening of its downstream target genes to further validation of the mechanisms of YMO1. Thirdly, using phage random peptide libraries to screening, purification and verify the functional peptides of YMO1 protein. And with the use of tail vein injection method and Ymo1 gene-knockout mouse, we study the function of YMO1 functional peptides targeted intervention in the prevention and treatment of HCC invasion and metastasis. It is expected that this study will clarify the novel features and mechanisms of the inhibition of HCC invasion and metastasis of YMO1. And provide the experimental basis for further HCC strategies in prevention of invasion and metastasis.

阐明肝癌侵袭转移的分子机制是防治肝癌复发转移的关键。我们前期研究发现YMO1在肝癌组织及肝癌细胞系中呈显著性低表达，且其表达与肝癌血管侵犯、总体生存时间和无瘤生存时间密切相关；过表达YMO1能明显抑制肝癌细胞的侵袭转移能力。因而我们推测其在肝癌侵袭转移调控中起关键性作用。本研究拟首先利用质粒转染和动物活体成像技术，采用裸鼠原位种植肝癌模型与Ymo1基因敲除小鼠模型，在体内外验证YMO1抑制肝癌侵袭转移的新作用；进而利用蛋白芯片技术，结合文献综合分析，通过免疫共沉淀筛选其下游靶蛋白，采用体内外试验进一步验证，旨在阐明YMO1的作用机制；再采用噬菌体随机多肽文库技术筛选、纯化和验证YMO1功能性肽段，利用Ymo1基因敲除小鼠模型研究其功能性肽段靶向干预对肝癌侵袭转移的作用。预期本项目将阐明YMO1抑制肝癌侵袭转移新的功能及其作用机制，为研发针对肝癌复发转移新的靶向药物奠定坚实的理论基础。

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种临床最为常见的恶性肿瘤。随着肝脏外科技术的发展，肝癌的手术切除率不断提高，但肝癌术后的转移复发已成为严重制约提高肝癌长期生存率的主要障碍。深入研究肝癌复发转移的分子机制，有助于探索有效的预防和治疗复发转移的手段，对进一步提高肝癌患者术后整体治疗水平具有重要意义。嵌合体眼状蛋白1（Yurt/Mosaic eyes-like 1，YMO1），又名EPB41L5，是新近发现的与胚胎原肠胚发育的蛋白，广泛表达于哺乳动物胚胎中、内胚层上皮组织。鉴于其具有调节细胞肌动蛋白骨架，调节细胞粘附分子，基底膜形成及细胞极性等功能，且在胚胎中的定位与成体肝脏一致，提示 YMO1 可能参与了肝癌侵袭转移过程。因此，本课题以YMO1作为研究目标，探讨其在肝癌中的表达水平、临床意义、生物学作用及相关机制。.我们前期预实验结果发现4.1蛋白家族的7个成员中，YMO1在肝癌组织中的表达下调。进一步采用 Realtime PCR 和 Western blot 检测肝癌组织及细胞系YMO1 mRNA 和蛋白的表达水平，证实YMO1 mRNA 和蛋白在肝癌组织及细胞系中表达明显降低。采用免疫组化法检测 155 例 HCC 组织中 YMO1 的表达，结果显示肝癌组织中 YMO1 蛋白阳性表达率（63/155，40.6%）明显低于邻近非癌肝组织（131/155，84.5%），且其表达水平与肝癌临床病理特征及不良预后显著相关。通过划痕愈合、Transwell、细胞粘附、MTT等试验证实YMO1的表达可显著抑制肝癌细胞的侵袭运动能力而对其增殖能力并无影响。裸鼠皮下成瘤及原位成瘤模型在体内证实YMO1显著抑制肝癌细胞的成瘤及侵袭转移能力。机制研究发现YMO1与RhoC存在相互作用并调控RhoC活性来抑制肝癌的侵袭转移。进一步利用SABiosciences的DECODE转录因子数据库并通过双荧光素酶报告基因系统、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）以及Western blot等方法证实转录因子PAX5可以调控YMO1的表达。.基于上述，我们证实YMO1是一个潜在的肝癌转移抑制基因和预后标志物。