肝癌细胞改造微环境重塑适于肝癌侵袭转移的作用机制研究

Numerous studies have demonstrated that the tumor microenvironment plays an important role in the the carcinogenesis, progression, invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the mechanism of how HCC cell remodel microenvironment is still far from clear. A large number of studies have confirmed that the stroma cells of microenvironment such as carcinoma-associated fibroblasts(CAF), tumor associated macrophages(TAM) and tumor endothelial cells play a pivotal role in the developoment of HCC. Our previous studies have shown that those cells in the tumor microenvironment are regulated by Egfl7 and JMJD6. Therefore, we speculate that Egfl7 and JMJD6 may promote the invasion and metastasis of HCC through remodling the cellular components of microenvironment. We plan to adopt techniques such as real-time PCR, western blot, IP, IHC, Lentiviral vector transfection, cell co-culture, IVIS Xenogen technique and gene knock-out mouse technology to verify the role of Egfl7 and JMJD6 in vitro and in vivo. And then, the laser capture microdissection and gene chip technology will be adopted to find out the targeted genes of Egfl7 and JMJD6. These results will be further confirmed in HCC samples. Through presetnt study, we will clarify the role of HCC cell remodels microenvironment and make it suitable for facilitating HCC invasion. And it will provide important theoretical basis in researching the new target drugs for HCC.

肿瘤微环境在促进肝癌发生发展、侵袭转移过程中具有重要作用，但目前肝癌细胞如何改造重塑微环境的作用机制尚知之甚少。已有研究证实肿瘤微环境中的CAF、TAM和肿瘤内皮细胞在肝癌的侵袭转移中发挥了非常重要的作用。我们前期研究显示Egfl7、JMJD6参与了对微环境中的上述细胞的调控，故我们推测Egfl7、JMJD6可能通过改造微环境中某些细胞成分从而发挥促进肝癌侵袭转移作用。为此，本研究拟利用real-time PCR、western blot、IP、IHC、慢病毒转染、细胞共培养、活体荧光成像技术及基因敲除鼠等技术在体外和体内验证肝癌细胞改造微环境的作用；继而利用激光显微切割、蛋白芯片技术结合前期研究工作，筛选其下游靶基因，开展体内、外试验，并在人体肝癌组织进行验证，有望阐明肝癌细胞对微环境改造、重塑更有利于肝癌侵袭转移的微环境的作用机制，为研发新的肝癌靶向药物提供新的策略并奠定重要理论基础。

尽管近年来随着早期诊断和外科治疗技术的提高，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发病率和死亡率都呈下降趋势，但由于肝癌术后复发转移率居高不下，使其远期疗效并不理想。因此，深入探究肝癌复发转移的分子机制，对充分理解其生物学行为并制定有效的干预措施具有十分重要的意义。目前研究多关注肝癌肿瘤周围微环境在肝癌的侵袭转移过程中发挥的作用，而肝癌细胞在微环境中的作用及如何改造重塑微环境尚知之甚少。本项目以孤立性大肝癌为切入点，以期进一步深入探究肝癌对微环境中肿瘤相关成纤维细胞（CAF）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤血管内皮细胞的改造重塑作用机制以及对肝癌侵袭转移能力的影响。.本项目发现肝癌组织中CAF、TAM浸润显著增多，JMJD6的表达也显著上调，而且其浸润增多和高表达与肝癌的临床病理特征和不良预后显著相关，并且是影响肝癌患者预后的独立危险因素。进一步分析显示Egfl7与CAF、TAM的浸润显著相关，提示Egfl7可能参与CAF、TAM的改造重塑过程。我们采用原代培养技术获得CAF、肝脏成纤维细胞和骨髓起源的巨噬细胞（BMDM），并通过共培养体系及一系列体外实验证实肝癌细胞确实能通过分泌Egfl7募集激活LF、BMDM分别使其转变为CAF、TAM。接着利用肝癌细胞原位种植模型并结合小动物活体成像系统在体内证实了Egfl7在肝癌细胞募集激活LF、BMDM并促进其侵袭转移中发挥关键作用。在机制方面，Egfl7可分别通过LF和巨噬细胞的ανβ3和EGFR受体激活FAK/AKT和Notch通路，从而促进LF和TAM的募集和激活。其次，进一步研究发现Egfl7募集激活的CAF可通过分泌CTGF促进肝癌细胞的侵袭转移。此外，我们证实JMJD6在体外可促进肝癌血管内皮细胞的迁移和成管能力，在体内可促进肝癌血管生成和转移。机制上，JMJD6通过靶向作用于sFLT从而影响VEGFR的活性，促进血管生成，进而促进肝癌的侵袭转移。.本项目创新性地系统研究肝癌细胞对微环境中CAF、TAM和血管内皮细胞的募集、调控与改造、重塑作用，这将有助于阐明肝癌发生发展和侵袭转移的新机制，并为后续研发针对肝癌靶向治疗的新靶点提供全新的思路和方法。