苦参碱衍生物MASM调控肝内巨噬细胞表型转换及其机制研究

Our previous studies have found that the matrine derivative MASM exhibits potent anti-fibrotic effect and modulates macrophage polarization as well as prompts phenotypic switch of hepatic macrophages. Moreover, MASM specifically binds to ribosomal protein S5 (RPS5). RPS5 knockdown in macrophages increases production of pro-inflammatory cytokines and reduces the actions of MASM. In addition, RPS5 is found to interact with ERK、AKT and GSK3β. These findings suggest that RPS5 may mediate the effect of MASM on phenotypic switch of hepatic macrophages and participate in the pathological process of liver fibrosis. There are not any reports about MASM modulation on hepatic macrophages and involvement of RPS5 in hepatic fibrosis at present. .This project will validate anti-inflammatory and anti-fibrotic mechanisms of MASM. This may be involved in that binding of MASM to RPS5 modulates the phosphorylation and activities of ERK、AKT and GSK3β, which leads to alternation of downstream transcriptional factor CREB phosphorylation and C/EBPβ transcription, and ultimately prompts phenotypic switch of hepatic macrophages. In addition, RPS5 conditional knockout mouse (Lyz2-Cre：Rps5flox/flox) will be used in vitro and in vivo to study the role of RPS5 in the pathological process of liver fibrosis. Meanwhile, we will study whether beneficial effect of MASM on hepatic fibrosis is lost in such systems. Together，our results will clarify the molecular mechanism of MASM for its anti-fibrotic effects and point to RPS5 as a therapeutic target for liver fibrosis.

我们前期研究发现苦参碱衍生物MASM具有抗肝纤维化作用并能调控巨噬细胞（Mφ）M1/M2极化及促进肝内Mφ表型转换，还能特异性结合核糖体蛋白S5（RPS5），而RPS5沉默则增加促炎细胞因子产生并削弱MASM的作用，此外，RPS5还与ERK、AKT 和GSK3β相互作用，提示RPS5介导MASM促进Mφ表型转换并影响肝纤维化的进程。这些研究国内外未见报道。本项目拟揭示MASM通过结合RPS5，调控ERK、AKT 和GSK3β的磷酸化和活性，进而影响下游转录因子 CREB的活性，改变C/EBPβ的转录，最终调控Mφ极化或表型转换，发挥其抗炎抗肝纤维化的作用；采用基因敲除小鼠最终明确RPS5在肝纤维化中的作用及对MASM作用的影响。研究结果将阐明MASM抗肝纤维化作用的细胞和分子机制，揭示RPS5在肝纤维化中的作用，为肝纤维化治疗提供新的靶点和药物。

我们前期研究发现苦参碱衍生物MASM具有显著的抗肝纤维化作用，能特异性结合核糖体蛋白S5（RPS5），本项目主要就MASM抗肝纤维化作用的细胞及分子机制展开研究，揭示RPS5在肝纤维化中的作用。首先，我们研究证实苦参碱衍生物MASM能够调控巨噬细胞表型转换，促进M1型向M2型极化，并抑制LPS和MCP-1诱导的巨噬细胞迁移。体内急慢性肝损伤模型证实MASM通过降低肝脏MCP-1的表达和抑制迁移作用，减少Ly6Chi单核细胞迁移入肝，并促进M1向M2型极化，从而发挥抗肝纤维化作用，对Ly6Chi单核细胞向Ly6Clo的转化作用并不显著。为了进一步阐明MASM的作用机制，我们从RPS5入手探究其在巨噬细胞及肝纤维化中的作用。研究发现，肝内巨噬细胞RPS5的表达水平在肝纤维化过程中显著下调，LPS刺激亦可降低RPS5的水平，而敲减RPS5能够促进巨噬细胞的炎症应答，增加多种炎症细胞因子和趋化因子的表达，表明RPS5可能参与巨噬细胞功能调节并影响肝纤维化进程。机制研究发现，RPS5沉默能够组成性活化p-p65和p-STAT3，激活NF-κB和JAK/STAT通路。进一步，我们构建了RPS5髓系敲除小鼠，确证了RPS5的敲除效果以及促进巨噬细胞炎症应答的作用。接着，我们利用该小鼠建立CCl4急性肝损伤模型，结果发现RPS5髓系敲除小鼠肝脏炎症细胞浸润较少，肝内多种炎症细胞因子表达显著低于对照组，该结论与体外结果并不一致。接着，我们构建了CCl4和BDL肝纤维化模型，结果发现RPS5髓系敲除可缓解肝脏组织损伤，减少胶原沉积，抑制肝星状细胞活化，减轻肝纤维化。同时，我们还发现RPS5髓系敲除小鼠肝脏巨噬细胞数显著低于对照组，这合理解释了体外RPS5敲减促进炎症应答，体内却能够缓解急性肝炎和肝纤维化这一结论。而小鼠全血白细胞计数排除了RPS5髓系敲除对单核细胞等多种髓系细胞数量的影响，因此，我们推测RPS5髓系敲除可能影响了单核细胞的迁移功能或者抑制了MDSCs（Myeloid-derived suppressor cells，骨髓来源的抑制性细胞）或单核细胞向巨噬细胞的分化功能。这些研究内容仍在进行中，RPS5是否介导了MASM的抗肝纤维化作用仍然需要深入探索。