含软骨钙化层结构的仿生诱导支架联合人脐带间充质干细胞构建组织工程骨软骨

Currently, the strategies of osteochondral tissue engineering always ignored the important role of cartilage calcified layer (CCL), which isolated microenvironment of bone and cartilage, causing microenvironment disorders and poor quality of regenerated osteochondral tissue. Based on the early study of biphasic osteochondral scaffold without CCL structure, this project intends to fabricate a bionic osteochondral scaffold with CCL structure and controlled released dural growth factors(GF) (rhBMP-2 and TGF-β3) using cartilage extracellular matrix (CECM), n-HA and silk fibroin (SF) biomaterials. The scaffold provides independent microenvironment for seed cells and controlled release of different GF in different regions of the scaffold, achieving the directed differentiation of seed cells to repair osteochondral defects. GFP-labeled human Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells (hWJ-MSCs)/scaffold constructs would be evaluated in intro, and be inserted in vivo into osteochondral defects of high-load-bearing area of rabbit knee (the scaffold without CCL structure and / or controlled release double GF for control). The quality of regenerated osteochondral tissue and biological behavior of hWJ-MSCs would be investigated. The effects of different scaffold designs on osteochondral defect regeneration quality and biological behavior would be evaluated and its mechanism be explored. This projects would provide new biomaterials and new strategies for osteochondral tissue engineering.

目前，组织工程骨软骨的构建策略多忽视软骨钙化层(CCL)隔离骨、软骨微环境的重要作用，导致微环境紊乱，再生骨软骨质量缺陷。本项目拟在前期无CCL骨软骨双相支架的研究基础上，采用软骨细胞外基质、n-HA、丝素蛋白为材料,设计和制备含"CCL"及"控释双生长因子（GF）（rhBMP-2和TGF-β3）"的仿生骨软骨诱导支架。该支架为植入的种子细胞提供差异化的独立诱导微环境，并在支架不同区域控释不同的GF，实现种子细胞定向分化修复骨软骨缺损。采用体外和体内模型（兔膝关节骨软骨缺损），将GFP标记的人脐带间充质干细胞（hWJ-MSCs）与支架复合并植入缺损，以无"CCL"和/或"控释双GF"设计组为对照，通过对骨软骨缺损再生质量的检测及hWJ-MSCs在体内生物学行为的观察，探讨不同的支架设计对骨软骨再生及hWJ-MSCs生长、分化及转归的影响及机制,为组织工程骨软骨仿生构建提供新材料和新策略。

目前，组织工程骨软骨的构建策略多忽视软骨钙化层(CCL)隔离骨、软骨微环境的重要作用，导致微环境紊乱，再生骨软骨质量缺陷。本项目拟在前期无CCL骨软骨双相支架的研究基础上，采用软骨细胞外基质、n-HA、丝素蛋白为材料，设计和制备含“CCL”及“控释双生长因子（rhBMP-2和TGF-β3）”的仿生骨软骨诱导支架。该支架为植入的种子细胞提供差异化的独立诱导微环境，并在支架不同区域控释不同的GF，实现种子细胞定向分化修复骨软骨缺损，为组织工程骨软骨仿生构建提供新材料和新策略。我们利用丝素蛋白和羟基磷灰石结合石蜡球浸出和改良温度梯度热诱导相位分离技术，制备一种新型的三层支架。该仿生支架具有三层结构特征:纵向微管结构的软骨层、三维多孔结构的骨层以及致密结构的中间层，具有良好的生物相容性。在体外软骨或成骨诱导培养基条件下，ADSCs可分别在软骨和骨层诱导分化为软骨细胞或成骨细胞。此外，中间层还可以起到隔离作用，防止软骨层和骨层内的细胞相互混合。我们采用温度梯度热诱导相位分离技术，将丝素蛋白（SF）与脱细胞软骨细胞外基质结合，制备复合支架（S/D）。所制备的支架具有显著的力学性能和仿生结构。此外，转化生长因子TGF-β3负载于支架上显示出控释特性，并在培养ADSCs 28天后增强了其软骨分化。S/D支架本身可以在不引入其他控释介质的情况下提供缓释系统，具有商业化和临床应用的潜在。甲苯胺蓝、番红O、免疫组化染色及II型胶原表达分析结果显示，培养28天后，所有支架均维持软骨表型。其中添加TGF-β3的最明显。连续释放TGF-β3的S/D复合支架可以在体外模拟再生微环境，增强ADSCs的软骨分化。