CS-胶原改性的PCL/脱细胞髓核基质仿生支架联合人脐带间充质干细胞构建组织工程椎间盘

Tissue engineering is expected to the ideal method for the treatment of disc disease, however, there is lack of ideal scaffold materials, which need to be explored in the further study. In our prior study, oriented anulus fibrosus (AF) scaffold has been fabricated with polycaprolactone (PCL) through a wet spinning-forming technique, and gelatinous nucleus pulposus (NP) scaffold has been fabricated with acellular NP matrix. In this project, integrative AF-NP biphasic scaffolds will be developed with PCL and acellular NP matrix, and modified with chondroitin sulfate (CS)-collagen. Human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSCs) will be differentiated into intervertebral disc (IVD) like-cells by co-culturing with AF/NP cells. Integrative AF-NP composites will be engineered with AF-NP biphasic scaffolds and IVD-like cells induced from HUCMSCs. The engineered AF-NP composites will be transplanted into the animals to repair degenerative disc, with the result being evaluated, including the changes of disc height index (DHI), cell proliferation, distribution, differentiation and gene expression, extracellular matrix secretion and arrangement, and mechanical properties in different portion of the composites (AF, NP, junctional zone). As far as we know, there is no literature that reported the construction of tissue-engineered IVD with the integrative AF-NP biphasic scaffolds fabricated with PCL and acellular NP matrix. This project will not only provide novel technology and direction for the reparation and reconstruction of IVD, but also promote the clinical application of tissue engineering for the reparation of IVD.

组织工程有望成为椎间盘疾病的理想治疗措施，但目前尚无公认的理想支架材料，亟需寻求一种理想的椎间盘支架。前期研究中我们以聚己内酯（PCL）为材料通过湿纺-成形技术制备具有取向性的纤维环支架，以脱细胞髓核基质为材料制备胶冻样的髓核支架。本课题以PCL、脱细胞髓核基质为材料研制硫酸软骨素（CS）-胶原改性的一体化纤维环-髓核双相支架；通过与纤维环细胞/髓核细胞共培养，诱导人脐带间充质干细胞向椎间盘样细胞分化；利用向椎间盘样细胞诱导分化的人脐带间充质干细胞与双相支架复合构建纤维环-髓核复合组织；将构建的纤维环-髓核复合组织移植到动物体内修复椎间盘退变，并评估修复效果，包括椎间盘高度指数变化，不同部位（纤维环、髓核、交界区）的细胞增殖、分布、分化及基因表达，细胞外基质分泌及排列，力学特性等。此研究国内外未见报道，研究成果将为椎间盘的修复与重建提供新的技术和方向，促进组织工程修复椎间盘的临床应用。

椎间盘退变性疾病是一类临床常见病，常常导致患者劳动能力丧失，目前尚无理想的修复重建措施。组织工程技术有望成为椎间盘疾病的理想治疗措施，但目前尚无理想的支架材料，由此我们进行了四方面的研究：.第一，在组织工程椎间盘支架的研制方面进行了探索。以聚己内酯（polycaprolactone，PCL）为材料通过湿纺-成形技术制备了环形取向性PCL纤维环支架，并在此基础上进行改良，通过熔融纺丝技术制备了具备60度斜交叠层结构的PCL纤维环支架；以脱细胞髓核基质为材料制备了胶冻样的髓核支架；将两种材料复合研制一体化PCL/脱细胞髓核基质双相支架。一体化双相支架生物相容性好，与天然椎间盘结构相似、力学性能相近，为构建组织工程椎间盘提供了一种理想的支架材料。.第二，在组织工程椎间盘种子细胞方面进行了研究。人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs）具有来源广泛、易于获取、无免疫排斥反应等诸多优点，分离培养了HUCMSCs，通过共培养技术成功诱导HUCMSCs向椎间盘样细胞分化，通过不同细胞比例共培养获取了最佳诱导效果的细胞比例，为组织工程椎间盘种子细胞的选择提供了一个新的方向。.第三，体外构建一体化纤维环（annulus fibrosus，AF）-髓核（nucleus pulposus，NP）复合组织。将诱导分化的HUCMSCs与双相支架复合培养体外构建了一体化AF-NP复合组织，组织学染色可见细胞均匀地粘附于支架内部、分泌大量细胞外基质（Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖）。.第四，体内修复退变椎间盘。将体外构建的一体化AF-NP复合组织移植到大鼠体内修复退变的椎间盘，体内培养一定时间后进行检测，可见组织工程椎间盘大体形态与天然椎间盘相近，HE染色可见细胞均匀地粘附在支架内部。番红“O”染色和免疫组织化学染色可见纤维环相含有大量的Ⅰ型胶原和蛋白聚糖、髓核相含有大量的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。Live/Dead染色显示细胞活性良好。力学性能检测显示组织工程椎间盘压缩弹性模量与天然椎间盘无明显差异。.此研究为椎间盘的修复与重建提供新的技术和方向，为组织工程椎间盘的临床应用奠定了理论基础。