水稻液泡磷酸盐转运体SPX-MFS蛋白的翻译后调控分子机制研究

Higher plants store the most abundant of phosphate (Pi) inside vacuoles. Vacuoles play crucial roles in maintaining the intracellular Pi homeostasis. We have recently demonstrated OsSPX-MFS3 is a low-affinity Pi transporter responsible for Pi export from the vacuole into cytosol. However, the regulation mechanisms of how SPX-MFS proteins are transited through the ER to tonoplast, stabilized in tonoplast and degraded remain unknown. Specific interests in this study include: 1) to verify the vacuolar target sites by site-mutation of SPX-MFS and subcellular localization of GFP fused proteins; 2) to determine the transmembrane topology (e.g. the N terminal SPX domain is localized at the cytosol or inside the vacuole) using roGFP2 technology; 3) to identify the SPX-MFS interacting proteins (probably the phosphorylation kinases and proteins involved in degradation of SPX-MFS) by split-ubiquitin yeast two-hybrid (Y2H) screening, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC), in vitro pull-down and Co-Immunoprecipitation (Co-IP); 4) to analyze the spatial-temporal expression patterns of SPX-MFS interacting proteins at transcripts/proteins levels, and to explore the physiological and molecular phenotypes of corresponding transgenic plants under Pi sufficient/deficient conditions. This study aims to reveal the post-translational regulation of SPX-MFS proteins, and to investigate the function of the potential SPX-MFS interacting proteins on regulating Pi signaling network and Pi homeostasis, which will provide insights into developing rice varieties with improved Pi utilization efficiency.

液泡储存了植物细胞绝大多数的磷，对于平衡胞内磷稳态具有重要作用。本实验室前期报导了首个水稻液泡磷转运体OsSPX-MFS3，但对其从内质网运输到液泡的调控机制以及在液泡膜的稳定性和蛋白降解机制尚不清楚。本项目拟对SPX-MFS蛋白翻译后调控机制开展研究，包括：1）利用点突变和GFP亚细胞定位，确定其液泡定位信号；2）运用roGFP2技术明确其跨膜拓扑结构，确定N端SPX结构域是在胞质还是液泡内感知磷变化。3）利用分裂泛素酵母双杂、BiFC、pull-down和Co-IP等技术筛选并鉴定SPX-MFS的互作蛋白，期望获得其磷酸化激酶或介导降解的蛋白。4）分析互作蛋白在转录水平和蛋白水平的时空表达模式、相关转基因材料在供磷和缺磷时的生理表型和基因表达等，阐明其生理功能。本研究旨在解析SPX-MFS蛋白翻译后调控的分子机制，以及其互作蛋白在磷信号和磷稳态的功能，为培育磷高效水稻品种提供新的思路。

液泡储存了植物细胞绝大多数的磷，对于平衡胞内磷稳态具有重要作用。前期研究表明，OsSPX-MFSs蛋白为水稻液泡磷酸盐转运体，本研究的目标是进一步明确其功能和翻译后调控机制。.1. OsSPX-MFSs是液泡磷酸盐内流转运体，且OsSPX-MFS3起主导作用.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得各种osspx-mfs突变体。根和成熟叶及根液泡Pi浓度测定结果表明，OsSPX-MFSs都是液泡Pi内流转运体，且贡献依次为3>1>2。水培生理试验表明，OsSPX-MFSs功能缺失会改变Pi的亚细胞分配，使更多Pi滞留在细胞质中，进而通过木质部转运到植物顶端组织。osspx-mfs1/3和1/2/3的叶尖和小穗有严重的磷积累引起的中毒性斑点，但低磷条件可缓解其生长迟缓和磷中毒症状。田间低磷环境下，osspx-mfs1、2的产量显著高于野生型。.亚细胞定位结果表明，OsSPX-MFSs蛋白中SPX结构域对Pi浓度的感知及其本身磷酸化状态，都会影响其液泡膜定位。利用分裂泛素酵母双杂MYTH筛选水稻cDNA文库，获得17个候选互作蛋白，包括两个突触融合蛋白syntaxin和三个含RING结构域的E3泛素连接酶。根据MYTH验证及共定位情况，后续选择OsSYP21/22和OsRING1开展功能研究。.2. OsSYP22通过蛋白互作协助OsSPX-MFS3定位到液泡膜.MYTH和BiFC结果表明OsSYP22通过N端的SynN结构域与OsSPX-MFSs互作。测序结果显示基因编辑不能获得ossyp22纯合移码缺失突变体，即ossyp22纯合缺失致死。亚细胞定位和BiFC结果表明，OsSYP22表达异常会阻碍OsSPX-MFS3正确定位至液泡膜；且SPX结构域对胞内Pi浓度的感知决定了两者之间是否互作。.3. OsRING1与植物适应低能量环境和体内氮源代谢有关.表型分析发现osring1/2生长迟缓，而OsRING1-OE的株高、分蘖数、单株粒重和粒数都显著增加。qRT-PCR和GUS染色结果说明，OsRING1表达受缺糖(碳源供应)的诱导。且在低光照强度下，与野生型相比，突变体较差，超表达材料更好。OsRING1功能缺失或超表达会影响叶片和种子中的氨基酸和总氮含量。故推测OsRING1具有提高产量的潜能，有利于植物适应低能量水平。且可能与植物体内氮源代谢过程有关。