蒺藜苜蓿液泡磷转运体的功能鉴定与调控机理研究

Medicago is one of the most important leguminous forages, and also phosphate preference plant. The vacuolar phosphate pool is essential for maintaining phosphate homeostasis in plant cells, whereas the vacuolar phosphate transporters and their regulation pathways are completely unclear in Medicago plants. According to previous studies, the SPX-MFS family members are likely to be plant vacuolar phosphate transporters, but their transport directions and activities are diffident. We plan to identify the molecular function of MtSPX-MFS in Medicago truncatula by heterologous expression in Arabidopsis vpt1 (vacuolar phosphate transporter 1) mutant and VPT1 over-expression (VPT1-OEX) plants, and by medicago mutant. On the other side, we speculate that members in MtSPX and MtSPX-RING families have regulations on protein activities and levels of MtSPX-MFS respectively. We plan to identify the protein-protein interaction by yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation (BiFc) methods, and identify the molecular function of protein interaction by Dexamethasone (DEX) inducible expression system construction, RNAi, Western-blot, 31P-NMR, Patch-clamp and other methods. This study not only could uncover the phosphate homeostasis mechanism of Medicago plants on vacuole aspect, but also could provide more paths for engineering better phosphate efficient Medicago plants.

液泡磷对于维持细胞的磷素平衡至关重要，作为重要的豆科牧草，苜蓿的液泡磷转运体及其调控途径完全不清楚。研究表明，SPX-MFS家族蛋白是植物的液泡磷转运体，但它们的转运方向及活性各有不同。我们将以蒺藜苜蓿为材料，采用拟南芥液泡磷转运体vpt1突变体和VPT1过表达植株中异源表达来筛选苜蓿MtSPX-MFS家族中的功能蛋白，再用苜蓿突变体对MtSPX-MFS的分子功能进行深入鉴定。基于MtSPX和MtSPX-RING家族蛋白对MtSPX-MFS的活性和蛋白水平调控的推测。拟通过酵母双杂和双分子荧光互补（BiFC）试验证实蛋白-蛋白互作关系。利用DEX(地塞米松)诱导、RNAi等方法控制目的基因的表达，结合Western-blot、31P-NMR、膜片钳等技术为上述推测提供直接证据。本研究不仅可从液泡水平上揭示苜蓿的磷素平衡机制，也可为苜蓿的磷素高效利用及分子育种提供科学依据。

液泡磷对于维持细胞的磷素平衡至关重要，作为重要的豆科牧草，苜蓿的液泡磷转运体及其调控途径完全不清楚。本项目对蒺藜苜蓿液泡磷转运体MtVPT家族成员的分子功能及其蛋白降解途径进行了研究，而且对研究过程中发现的其它新的蛋白分子功能也进行了探索。结果表明，MtVPT2和MtVPT3基因不仅在不同的叶片和根中对低磷胁迫具有积极响应，在根瘤中也有较高的表达水平并对低磷也会作出积极响应。进一步研究表明，mtvpt2和mtvpt3突变体在低磷条件下的结瘤数量明显较野生型更少。微生组分析表明mtvpt2和mtvpt3的根系真菌群落与野生型之间发生了很大的变化，说明MtVPT2和MtVPT3决定着蒺藜苜蓿与根瘤菌的共生及其根系与真菌之间的互作。NLA属E3泛素连接酶，包括MtNLA2在内的多个NLA家族成员能与MtVPT1互作。通过CRISPR/cas9基因敲除证实MtVPT1在蒺藜苜蓿液泡磷储存中参与重要作用。根中MtNLA2基因的表达不仅受高磷诱导，也受低磷胁迫诱导。在低磷低氮条件下，mtnla2突变体对低磷较野生型敏感，且磷的根-叶转运效率降低。MtVPT1在mtnla2突变体中过表达较野生型中过表达更能抑制根中的磷向地上部位转运。因此，低磷胁迫下MtNLA2能够降解MtVPT1以促进磷由根向叶片中转运。通过花青素合成缺陷突变体ans-3和tt8证实花表素代谢能够调控无机磷和砷酸盐在蒺藜苜蓿叶片中的累积和分布，而包括MtVPT家族基因在内的磷转运体在其中参与重要的角色。此外，在筛选鉴定MtVPT突变体时，我们定位并研究表明一个新的蛋白MtSPP1在叶绿体的光损伤修复、光合复合体组装、光呼吸调控等过程参与重要作用。本项目的研究不仅能够为液泡磷转运体的分子功能和调控途径提供了新的认识，还为苜蓿等豆科牧草的耐低磷等性状的遗传改良提供了新的思路。