水稻缺铁响应相关bHLH转录因子的调控机制研究

Iron (Fe) is an essential micronutrient element for rice growth and human health. Studying on the molecular mechanism of Fe deficiency response in rice will expand the signaling pathways and regulatory networks of Fe acquisition, metabolism and homeostasis in plant, and provide molecular basis to develop rice varieties with improved Fe content. In this project, we are going to construct Fe signaling networks in rice, by exploring the interaction proteins and downstream regulation genes of rice Fe signaling related bHLH transcription factors OsIRO3, OsbHLH133, OsbHLH-IR3 and OsbHLH-IR4. Specific interests include: 1) functional characterization of function-unknown OsbHLH-IR3 and OsbHLH-IR4 on Fe acquisition and metabolism in rice, and regulation mechanism of interaction between OsIRO3 and OsbHLH-IR4 on Fe signaling; 2) to identify the interaction proteins of these four bHLH transcription factors, by Co-Immunoprecipitation (Co-IP), Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) and Yeast Two-Hybrid (Y2H) assays; 3) applying Chromatin Immunoprecipitation-Sequencing (ChIP-Seq) to identify downstream genes regulated by these transcription factors; 4) to develop regulatory networks of Fe signaling pathways in rice on the basis of bioinformatic analyses.

铁是水稻生长和民众健康必需的一种微量元素。研究水稻缺铁逆境胁迫响应的分子机制，可丰富植物铁吸收、代谢与平衡信号调控网络的理论基础，并指导富铁水稻品种的培育。本项目拟深入研究水稻铁信号相关bHLH转录因子OsIRO3、OsbHLH133、OsbHLH-IR3和OsbHLH-IR4的互作蛋白和下游调控基因，构建水稻铁信号调控网络。研究内容主要包括：1）系统研究功能未知的转录因子OsbHLH-IR3和OsbHLH-IR4在水稻铁吸收代谢中的功能，以及OsIRO3与OsbHLH-IR4的互作在水稻铁信号的调控机制。2）利用免疫共沉淀与液相串联质谱鉴定技术、双分子荧光互补和酵母双杂等手段，分离验证上述四个转录因子的可能互作蛋白，并明确其作用机制。3）在上述两项研究结果的基础上，利用染色质免疫沉淀及高通量测序技术，分离鉴定这些转录因子直接或间接调控的下游基因。4）最后利用生物信息学方法进行数据的整合分析，建立铁信号调控机制的互作网络。

铁是水稻生长和民众健康必需的一种微量元素。研究水稻在缺铁逆境中铁吸收与铁稳态的分子调控机制，可作为指导培育富铁水稻品种的理论基础。本项目对几个水稻中缺铁响应相关的bHLH转录因子OsbHLH-IR3、OsIRO3和OsbHLH-IR4的基因功能进行了探究。OsbHLH-IR3是植物缺铁响应核心调控因子FIT在水稻中的同源基因，仅在根中受缺铁诱导，蛋白定位在植物细胞核中。bhlh-ir3突变体在缺铁环境下表现为超敏表型，如叶片失绿发黄、生长受抑制及植株中铁含量低于野生型。通过RNA-Seq分析bhlh-ir3中转录组的变化情况，发现其在缺铁条件下与野生型相比发生了非常大的转录组表达模式的改变。其中有259个基因在野生型中受缺铁诱导但在bhlh-ir3中与野生型相比被抑制；而有62个基因则相反，在野生型中受缺铁抑制但在bhlh-ir3中表达上调。进一步研究发现大部分编码铁吸收机制II 相关蛋白的基因在bhlh-ir3中的缺铁诱导被显著抑制。综上所述，OsbHLH-IR3转录因子是通过调控水稻基于机制II的铁吸收来正向调节铁稳态。另一方面，OsIRO3在叶片和根中均受缺铁强烈诱导，而OsbHLH-IR4仅在根中受缺铁微弱诱导。初步表型分析显示OsIRO3的过量表达或功能缺失，以及bhlh-ir4突变都能引起植株对缺铁较为敏感。通过酵母双杂、双分子荧光互补以及免疫共沉淀等试验，可证实OsIRO3和OsbHLH-IR4在水稻细胞内发生蛋白互作；可能作为植物细胞内铁浓度感受器的E3连接酶OsHRZ1/2也可与这两个转录因子结合；另外OsbHLH-IR4还可与OsIRO3的上游调控因子OsbHLH060形成异源二聚体。这些结果暗示OsIRO3和OsbHLH-IR4互作在水稻缺铁信号调控中具有一定功能，但还需要进行更加深入和细致的研究来明确其调控机制。本项目的研究成果补充完善了水稻铁吸收和铁稳态的分子调控网络。