水稻谷蛋白液泡分选决定因子确定及其作用机制研究

蛋白质从内质网向储藏液泡运输是由许多因子参与的复杂调控过程。蛋白必须含有液泡分选决定因子（VSD)才能与受体结合形成转运小泡，实现由ER向储藏液泡的定向运输。目前对VSD研究多限于少数双子叶植物的储藏蛋白，而对于水稻种子主要储藏谷蛋白所含VSD研究尚未见报道。本研究从水稻谷蛋白GluA-2部分氨基酸缺失导致其胞内转运受阻突变体入手，克隆GluA-2基因，对氨基酸缺失区域及其周围氨基酸逐个缺失或置换，与GFP构建融合蛋白表达载体，利用原生质体转化方法确定GluA-2中所含VSD的氨基酸,并决定其关键氨基酸，以期逐步揭示水稻谷蛋白胞内转运、修饰和储藏的遗传调控机制，对高等生物的蛋白胞内运输调控提出新的见解，具有重大的理论意义。同时对于实现水稻种子中外源蛋白定向运输与定点储藏，提高其表达和累积水平，促进水稻种子生物反应器产业化，以及培育保健功能性作物新品种等研究具有重要应用价值。

蛋白质从内质网向储藏液泡运输是由许多因子参与的复杂调控过程。蛋白必须含有液泡分选决定因子（VSD）才能与受体结合形成转运小泡，实现由ER向储藏液泡的定向运输。目前对VSD研究多限于少数双子叶植物的储藏蛋白，而对于水稻种子主要储藏谷蛋白所含VSD研究尚未见报道。本研究利用水稻谷蛋白GluA-2前体累积突变体EM1317为材料，解析其可能含有的VSD及其作用。EM1317突变体中谷蛋白前体增加，而成熟的酸性α-1亚基和碱性β-1亚基缺失。序列分析结果表明，突变体中GluA-2基因的基因组DNA序列发生了一个由G变为A的单碱基突变，致使其mRNA剪切位点发生改变，突变型GluA-2的mRNA缺少27个碱基，其编码的蛋白缺少9个氨基酸，其中6个氨基酸在所有的谷蛋白中高度保守。原生质体瞬时转化试验结果显示，这6个保守氨基酸中任何一个缺失或置换的GluA-2均滞留在内质网。胚乳特异性表达结果表明，缺失这6个氨基酸的GluA-2，GluA-1和GluB-4在转基因水稻胚乳中均以前体形式分布在内质网由来的PBI中。同样，缺失其中任何一个保守氨基酸的GluA-2在转基因水稻胚乳中也以前体形式分布在PBI中。这些结果表明，谷蛋白中保守的6个氨基酸对其由内质网向储藏液泡转运出起到决定性作用，是目前为止首次发现的谷蛋白内质网运出信号。