蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰在胚胎干细胞中的功能研究

Protein O-GlcNAc modification participates in regulating a series of important biological processes. This proposed project focuses on the functional role of dynamic O-GlcNAc modification in embryonic stem cells (ESCs). We will develop bioorthogonal labeling methods and chemical proteomic techniques for large-scale identification of O-GlcNAcylated proteins and modification sites in ESCs. Based on the proteomic profiling results, we will choose important transcription facts with O-GlcNAc modification and exploit the CRISPR/Cas9 technique to construct the knockout-rescue stable cell lines for these factors. In these cells, how O-GlcNAc regulates ESC self-renew and pluripotency through affecting the transcription network will be investigated. This project will facilitate our understanding of O-GlcNAc biology and promote the development of stem cell therapy-based regenerative medicine.

蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰参与调控一系列重要的生物学过程。本项目围绕O-GlcNAc动态修饰与胚胎干细胞功能的关系这一关键科学问题，发展针对胚胎干细胞中O-GlcNAc的生物正交标记方法和化学蛋白质组学分析技术，大规模鉴定O-GlcNAc修饰蛋白和修饰位点，并在胚胎干细胞中寻找O-GlcNAc识别蛋白。通过对组学鉴定数据的归纳分析，选定胚胎干细胞中具有O-GlcNAc修饰的关键转录因子，利用CRISPR/Cas9技术构建这些因子的敲除后回补稳定胚胎干细胞系，研究O-GlcNAc如何通过影响转录网络来调控胚胎干细胞的自我跟新和多能性维持。本项目的实施对于理解O-GlcNAc动态修饰的基本生物学性质，促进干细胞治疗等再生医学的发展都具有积极的意义。

本项目聚焦于“O-GlcNAc糖基化在胚胎干细胞中的功能调控”，在O-GlcNAc修饰的化学标记、蛋白质组学分析和O-GlcNAc修饰对胚胎干细胞功能影响等方面开展化学糖生物学研究。项目执行期间，按项目书研究计划开展工作，并根据研究进展和结果对研究方案进行了必要的调整和优化，主要开展了以下几个方面的研究工作:1)开发了新一代的非天然糖代谢标记探针，解决了传统全乙酰化非天然糖具有S-glyco-modification副反应的问题，实现了活细胞中聚糖的高特异性和高效率化学标记；2）构建了基于同位素标记的可切割富集标签的O-GlcNAc修饰位点的定量组学分析平台，实现了O-GlcNAc修饰组的位点鉴定和定量分析；3）开发了点击膨胀显微成像技术(click expansion microscopy, click-ExM)，提供了一种简便的、可以在常规共聚焦荧光显微镜上进行超高分辨聚糖荧光成像研究的新方法；4）发展了一种不依赖于polyA的RNA结合蛋白捕获鉴定的新技术CARIC，在整个转录组层面同时鉴定了编码RNA和非编码RNAs的结合蛋白，为研究细胞中蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰提供技术支持；5）研究了重要转录因子ESRRB的O-GlcNAc修饰和相关功能，探索了O-GlcNAc修饰对蛋白质稳定性和蛋白质相互作用的调控功能，在小鼠胚胎干细胞中对O-GlcNAc修饰蛋白进行了大规模鉴定。这些研究工作的开展为研究O-GlcNAc糖基化修饰组学鉴定与胚胎干细胞功能理解提供了新方法和更深入的理解，阐明了O-GlcNAc糖基化可促进ESRRB维持胚胎干细胞的多能性和自我更新能力。