生物正交聚糖标记在肠道微生物组研究中的应用

Gut microbes has an immense impact on human wellbeing. Due to the complexity of the microbiota, researchers are often faced with many technical challenges, including the difficulty of visulizing bacteria in the gut. Here, we propose to apply bioorthogonal glycan labeling in the microbiota for bacterial imaging. First, we will screen the gut microbiota in vitro, against our unnatural-sugar-probe collection by adding specific probes to the agar during anaerobic culture. The positively-labeled bacteria will then be sorted by FACS, sequenced and identified. The probes showing strong labeling will be used in the following in vivo metabolic labeling. After oral gavage, the probes will be metabolized in situ by the intestinal bacteira. By linking fluorophores onto the bacteria on the intestine cryo-section through a click reaction, a new method to image the gut microbiota is developed. Meanwhile, using the same strategy of bioorthogonal glycan labeling targeting the intestinal tissue and mucous, it will be possible to visulize, simultaneously, the glycan-containing structures from both mammalian tissues and gut microbiota. And these strucutres are very important in the intestinal immune system. This project will break new ground in microbiota research and pave the way for microbiota imaging. It will also help in deepening our understanding, from the viewpoint of glycans, of the relationship between the host and the microbiome in the development of the immune system.

肠道微生物对人体健康有重要影响，但肠道微生物组的研究仍存在研究对象复杂，研究手段有限等问题，尤其在肠道菌群成像上存在困难。我们计划利用生物正交聚糖标记肠道微生物组的方法实现对菌群的成像。首先利用我们已建立的非天然糖探针库，通过在培养基中加入特定探针的方式，在体外培养的肠道微生物组中进行标记以选出标记效率高的探针，利用流式细胞仪分选出有代谢标记的细菌后再测序鉴定种属，以此实现对多种肠道细菌的筛查。之后通过灌胃给药的方式使探针在小鼠肠道内进行原位的代谢标记，再在肠道组织切片上利用click反应将荧光基团偶联到细菌表面，以此实现菌群的成像。再结合使用生物正交聚糖标记肠道组织（所用探针不同）的策略，达到对肠道组织和微生物两者聚糖结构（在免疫过程中皆有重要作用）的同步观察。本项目的实施将开辟化学生物学方法在微生物组研究中的新领域，为解决肠道菌群成像和加深理解宿主与细菌在免疫系统中的相互关系奠定基础。

近十年，肠道菌群的研究突飞猛进，其对宿主生理功能和病理过程的影响也逐渐被揭示。然而，目前基于DNA测序、细菌培养组学、无菌小鼠等技术的传统研究方法在对菌群功能的深入挖掘中受到了明显的限制。针对这一构成复杂、功能多样的微生物体系，化学生物学的研究工具和思路有很大的应用空间。本项目围绕“化学标记在肠道微生物组研究中的应用”为核心，以开发化学标记工具为主要研究目标，发展了一系列用于成像和功能研究的新工具，实现了从单菌到菌群、从体外到体内的化学标记方法的开发与应用，解决了菌群中的革兰氏阳性和阴性菌的选择性荧光标记和外源菌群移植后在宿主体内的活性测定等两个关键科学问题。项目负责人以通讯或共同通讯作者发表论文13篇。.主要研究成果包括：.1.利用生物正交聚糖标记和基于窄谱抗生素的荧光探针，实现了对肠道菌群中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的特异性荧光标记，并将其应用到小鼠活体菌群的选择代谢标记以及多种复杂细菌体系的荧光染色之中，并有望应用在临床微生物诊断中辅助甚至替代传统的革兰氏染色。.2.开发了基于D型氨基酸荧光探针的活体序贯代谢标记策略（STAMP），首次实现了对粪菌移植过程中植入菌在受体小鼠中的分布进行追踪，并利用这一策略实现了对植入菌的活性的直观判断。.3.发展了首个可以在细菌中对RNA进行代谢标记的非天然核苷，并首次实现了对活体小鼠肠道菌群的新生成RNA的生物正交标记。