瑞氏木霉cAMP信号途径在纤维素—纤维素酶信号传导中的作用研究

瑞氏木霉是重要的纤维素降解模式菌株，从纤维素信号感受到纤维素酶表达的信号传递是纤维素酶合成的关键性前期调控阶段，但目前对此过程知之甚少。cAMP信号途径与碳源利用关系密切，对瑞氏木霉中该途径的了解有助于在深层次揭示纤维素酶表达调控机理。本研究采用系列荧光定量反转录PCR分析瑞氏木霉cAMP信号途径成员和相关组分Ras1/2以及纤维素酶表达调控蛋白在葡萄糖阻遏和纤维素诱导条件下的基因表达谱，分析基因表达规律；抑制瑞氏木霉非同源末端重组途径获得高效基因打靶菌株，建立高效基因敲除技术平台；构建cAMP信号途径重要成员腺苷酸环化酶、蛋白激酶A以及Ras1/2的基因敲除或RNA干扰株；检测突变株产酶性状和基因表达情况，分析上述信号途径成员之间的相互关系，明确cAMP信号途径在纤维素-纤维素酶信号传导中的作用。研究结果有利于阐明丝状真菌碳源信号传递这一重要生命过程，并为构建高效纤维素降解菌提供新思路。

瑞氏木霉是重要的纤维素降解模式菌株，从纤维素信号感受到纤维素酶表达的信号传递是纤维素酶合成的关键性前期调控阶段，cAMP信号途径与碳源利用关系密切。对瑞氏木霉该途径的了解有助于在深层次揭示纤维素酶表达调控机理。.本研究首先构建了瑞氏木霉与人类KU70同源的tku70基因敲除菌株，对△tku70菌株的随机基因敲除实验表明：在使用1kb同源区时，两个基因的敲除效率都大于95 %，远高于出发菌株5%-10 %的基因敲除效率。.以高同源整合率菌株Δtku70为出发菌株，构建了瑞氏木霉腺苷酸环化酶acy1敲除菌株Δacy1、回补菌株C1、蛋白激酶A两个催化亚基敲除菌株Δpkac1和Δpkac2。对上述突变株生长形态进行了检测。Δacy1和pkac1平板培养时生长迟缓，菌丝短而粗、不蔓延，生孢时间延长5-7天，在液体培养基中呈球状生长，生长量降低。ΔAcy菌株胞外纤维素酶活降低20-40%，cbh1基因表达水平为出发菌株的40%，显示腺苷酸环化酶（ACY1）对纤维素酶基因转录有正调控作用；而Δpkac1突变株内切及外切纤维素酶酶活提高30%-50%，cbh1基因表达水平提高10%左右，显示在本文弱光和无光试验条件下PKAC1对纤维素酶基因转录有负调控作用；Pkac2亚基单独敲除对菌株形态、生孢及酶活状况、纤维素产量等基本无影响，推测Pkac2蛋白对蛋白激酶A活性起辅助作用。以上实验结果显示cAMP/PKA信号传导途径对瑞氏木霉菌落形态、液体菌丝形态、生孢以及对纤维素-纤维素酶表达中的信号传递等起到重要作用。.对瑞氏木霉Ras1和Ras2基因的敲除实验结果表明，Ras1和Ras2 在瑞氏木霉菌丝顶端生长、菌丝分支形成、分生孢子形成和胞内cAMP水平调节等过程中有重要作用，两者发挥相似的功能，很可能通过cAMP信号途径调控上述发育过程。Ras2缺失使得瑞氏木霉产纤维素酶能力明显下降（为出发菌株的25%），而持续激活Ras2则使得纤维素酶分泌能力增强（提高1倍以上），显示Ras2可能介导了纤维素-纤维素酶信号的传递。检测了4种纤维素酶表达调控因子Xyr1、Ace1、Ace2和Cre1等表达情况，发现Ras2对Xyr1和Cre1的表达有正调控作用，对Ace1有负调控作用，而对Ace2的作用不明显。其中，Xyr1的表达受Ras2的影响最为明显。