蛋白激酶A调控瑞氏木霉纤维素酶表达的信号传递作用研究

从纤维素信号感受到纤维素酶表达的信号传递是瑞氏木霉纤维素酶合成的关键性前期调控阶段。cAMP依赖的蛋白激酶A在感应环境信号的传递中处于核心位置，但目前对其调控纤维素酶表达的信号传递作用知之甚少。对蛋白激酶A在纤维素酶合成中信号传递作用的阐明有助于深入揭示纤维素酶表达调控机理。本研究采用系列荧光定量反转录PCR分析瑞氏木霉蛋白激酶A、纤维素酶转录调控因子和纤维素酶系组分在葡萄糖阻遏和纤维素诱导条件下的基因表达谱，分析基因表达规律；在抑制瑞氏木霉非同源末端重组途径建立高效基因敲除技术平台的基础上，构建蛋白激酶A不同亚基系列基因敲除菌株；检测突变株产酶性状、基因表达情况、纤维素酶转录调控因子的丰度及磷酸化程度，分析蛋白激酶A对纤维素酶表达调控蛋白活性的作用和在纤维素酶合成调控中的信号传导作用。研究结果有利于阐明蛋白激酶A在丝状真菌碳源信号传递中的作用机理，同时为纤维素酶高产菌株改良提供新思路。

本项目围绕纤维素降解模式菌株瑞氏木霉的纤维素信号调控途径，深入研究了cAMP 依赖的蛋白激酶 A （PKA）信号途径在纤维素酶表达的信号传递的关键作用及其分子机制。本研究利用瑞氏木霉基因组数据对信号途径进行了全面分析，并首先抑制非同源末端重组途径构建起高效基因敲除菌株△tku70，然后进一步构建该信号途径中蛋白激酶 A 两个亚基pkac1和pkac2、腺苷酸环化酶基因（acy1）及相关Ras蛋白Ras1和Ras2等系列基因敲除菌株；借助表型分析、产酶性状、基因表达、胞内cAMP水平及转录调控因子的丰度的系统分析表明，缺失腺苷酸环化酶和PKA 催化亚基 1的菌株生长迟缓、菌落变小、菌丝不蔓延、生孢推迟，液体培养菌丝形态呈小球状；腺苷酸环化酶的活力直接决定了胞内cAMP水平，蛋白激酶 A 催化亚基 1（PKAC1）在蛋白激酶A活性中发挥主要作用；在调控纤维素酶表达方面，腺苷酸环化酶是纤维素酶表达的正调控因子，而蛋白激酶 A 催化亚基 1对纤维素酶基因的表达有负调控作用，蛋白激酶A催化亚基 2 对纤维素酶基因的表达基本没有影响；纤维素酶转录调控因子转录水平检测显示，纤维素酶活力的升高与xyr1表达水平提高密切相关。对cAMP/PKA信号相关Ras蛋白功能研究表明， TrRas1、TrRas2和TrRsr1在瑞氏木霉菌丝顶端发育、菌落形成及无性生殖等过程中发挥了重要作用，并发现TrRas1和TrRas2通过cAMP信号途径调控菌丝顶端延伸，这些发现加深了对Ras信号途径对丝状真菌发育调控过程的认识。首次发现信号调控蛋白TrRas2 在瑞氏木霉纤维素酶表达合成过程中发挥了正调控作用。TrRas2能够通过调节位于其下游的调控因子（如Xyr1）的表达量从而调控纤维素酶基因的表达。本项目开展的瑞氏木霉信号途径的主要核心蛋白的功能和分子机制研究，不仅丰富了我们对信号途径调控菌丝发育及纤维素酶合成过程的认识，同时，为进行以提高纤维素酶分泌为目的的菌株改良提供有价值的指导。