Rab35对小鼠卵母细胞成熟过程中极性形成的调控及机制

Mammalian meiotic maturation is characterized by a unique asymmetric division. The asymmetry is ensured by the migration and the anchoring of the spindle to the cortex. In addition, the establishment of polarity is necessary for the extrusion of small polar bodies. Oocyte polarity reduction or loss will cause the production of symmetric and polyploidy eggs and results in abnormal oocyte maturation and reduced fertilization efficiency. However, till now, the critical regulators and their molecular regulatory mechanisms remain to be discovered. In this study, we will investigate if the vesicle transport-related GTPase Rab35 is a novel regulator of oocyte polarity. Using RNA interference, overexpression and time-lapse microscopy, we will explore the regulatory roles of Rab35 on spindle migration and positioning, mouse oocyte polarity formation, actin expression and distribution as well as asymmetric division, and we will also investigate the mechanisms and establish the molecular signaling pathway for the regulation of oocyte polarity. This study will provide further understanding on molecular mechanisms of oocyte polarity formation and asymmetric division, and will establish a pivotal theoretical foundation for clarifying the effects of polarity on oocyte quality and female reproductive.

哺乳动物卵母细胞成熟是一种独特的不均等分裂。在成熟过程中纺锤体迁移并定位至卵母细胞皮质，最终建立极性。卵母细胞极性降低或丧失能够导致均等分裂和多倍体卵子，直接影响卵母细胞成熟和受精率。但到目前为止，对调节卵母细胞极性形成的关键因子及其分子机制了解的并不多。本项目将探索和证明囊泡运输相关GTP酶Rab35是一种新的极性调节因子，拟通过RNA干扰、基因过表达及活细胞工作站等技术探索其对小鼠卵母细胞纺锤体迁移和定位，极性形成，微丝的表达和分布及不均等分裂的调控作用，并在此基础上深入探索Rab35作用的分子机制和建立其调控卵母细胞极性的完整分子信号通路。本研究将拓展对卵母细胞极性形成和不均等分裂分子调控机制的认识，并为全面了解卵子极性影响卵母细胞质量和雌性生殖奠定重要的理论基础。

卵母细胞成熟质量的下降会引起受精或者胚胎发育失败，直接关系到动物生产的经济效益，也是导致人类生殖障碍的重要因素。卵母细胞成熟是一种独特的不均等分裂，在这一过程中，减数分裂纺锤体形成和微丝依赖的纺锤体迁移到皮质是卵母细胞成熟的关键，然而迄今为止，对这一进程的具体调控机制仍知之甚少。本研究通过Morpholino干扰，点突变mRNA注射等手段，围绕调控膜泡运输的Rab GTP酶家族蛋白Rab35，研究其在卵母细胞成熟过程中对微丝/微管骨架的调控，同时也探索Rab35作用的调控机制与分子信号通路。我们发现囊泡运输蛋白Rab35调控小鼠卵母细胞细胞成熟过程中细胞骨架动态过程。我们首先证实了Rab35在卵母细胞中的表达和分布，发现Rab35主要分布在卵母细胞皮质部和减数分裂纺锤体周围，这预示了Rab35可能参与了细胞骨架相关进程的调控；Rab35靶向Morpholino注射敲低Rab35表达，导致近半数卵母细胞极体排出率降低，此外发生对称分裂的比例显著升高。机制上的研究发现，Rab35缺失后可通过介导乙酰化/去乙酰化酶相关蛋白αTAT和Sirt2的表达水平的改变引起α-tubulin乙酰化水平的升高，从而干扰了微管稳定性并影响了减数分裂纺锤体组装和染色体整列，最终导致卵母细胞成熟障碍。此外，我们也发现卵母细胞中Rab35与微丝相关因子RhoA直接相关，Rab35缺失后可通过下调RhoA下游ROCK/cofilin信号通路的表达来干扰胞质微丝装配，进而影响了纺锤体迁移和卵母细胞不均等分裂。重要的是，将Myc-Rab35 cRNA微量注射到Rab35敲低的卵母细胞中可以显著地挽救Rab35缺失引起的细胞骨架异常及卵母细胞成熟缺陷。综合上述结果，我们的研究表明Rab35 GTP酶在小鼠卵母细胞成熟过程中具有多重调控作用，Rab35不仅介导纺锤体稳定性，也调控了微丝介导的纺锤体迁移。这一结果补充了对卵母细胞成熟调控的理论认知，对于卵母细胞质量控制和预防生殖缺陷有一定的理论价值。