弓形虫ROP5通过PKM2抑制巨噬细胞凋亡的作用及机制研究

Toxoplasma gondii is the opportunity for broad distribution of pathogenic protozoa, whose infection has become a serious public health problem worldwide. As the first barrier of body resistance to Toxoplasma gondii, macrophages are among the most susceptible-infected cells. Toxoplasma gondii can inhibit apoptosis of macrophages, to guarantee that the parasites within the macrophage, proliferation and had the opportunity to spread, which is one of Toxoplasma gondii immune escape mechanisms. Our previous studies have found, rhoptry protein 5 (ROP5) is an important apoptosis inhibitor in Toxoplasma gondii infection of macrophages, which interacts with host cells M2 isoform of pyruvate kinase (PKM2), play a role of the inhibitor of apoptosis together. This project intends using Real-time PCR, Western-blot, site-specific mutagenesis, Transfection, and CRISPR/Cas9 system gene editing technology to research combined regional or key amino acids of ROP5 and host cell PKM2 protein and the link between the upstream or downstream pathway in order to state ROP5 how to inhibit macrophage apoptosis through host PKM2, discuss new mechanism of apoptosis. It's important practical significance to provide the theoretical basis to find new drug targets, new vaccine candidate and control of Toxoplasma gondii.

弓形虫（Toxoplasma gondii） 是广泛分布的机会性致病原虫，其感染已成为严重的世界性公共卫生问题。作为机体抵抗弓形虫的第一道屏障，巨噬细胞是最容易受到感染的细胞之一。弓形虫可以通过抑制巨噬细胞凋亡的方式，来保证在巨噬细胞内寄生、增殖并有机会传播，是弓形虫免疫逃避的机制之一。我们前期研究发现，棒状体蛋白5（ROP5）是一个在弓形虫感染巨噬细胞中重要的凋亡抑制因子，能够与宿主细胞PKM2相互作用，发挥凋亡抑制的作用。本项目拟利用RT-PCR、Wb、定点突变、CRISPR/Cas9系统敲除基因等技术研究弓形虫ROP5与宿主细胞PKM2蛋白的结合区域、关键氨基酸，以及上、下游通路分子之间的关联，阐明弓形虫ROP5通过宿主PKM2抑制巨噬细胞凋亡及其上、下游信号通路的关系，探讨其凋亡抑制发生的新机制。为寻找新的药物作用靶点和新的疫苗候选分子提供理论基础，对弓形虫防治具有重要的现实意义。

刚地弓形虫是一种机会致病性的专性有核细胞内寄生原虫，全球约1/3的人口受到感染。我国人群的感染率为5%-20%。免疫功能正常的个体感染后常无明显临床症状，表现为隐性感染状态；但在免疫功能显著低下的个体（如艾滋病患者、器官移植病人等），则可因急性感染导致严重疾病甚至死亡。此外，弓形虫感染与优生优育有着密切的关系,弓形虫的先天性垂直传播则是导致不良妊娠结局的重要致畸因子之一。本项目以前期实验结果，弓形虫ROP5蛋白能够通过宿主PKM2抑制巨噬细胞凋亡为切入点。进一步探索弓形虫ROP5是通过哪个区域或哪些氨基酸与宿主细胞PKM2相互作用，来抑制细胞凋亡？同时，弓形虫ROP5上游分子（已报道的仅有ROP18）和宿主PKM2下游分子（已报道的NF-κB，Bcl-XL，H3 Histone，STAT3，p53，Bcl-2），系统研究弓形虫ROP5与宿主PKM2是通过具体哪些上、下游分子发挥抑制巨噬细胞凋亡的？对弓形虫感染抑制巨噬细胞凋亡信号通路是一次创新的探索。结果发现：（1）确定ROP5中间的假激酶区域（Pseudokinase domain，PD；位于373-1056bp，共682bp。对应氨基酸125-352aa，共228aa。）和巨噬细胞PKM2或与PKM2存在相互作用，其分子中221-223aa（TTV）在弓形虫ROP5和宿主巨噬细胞PKM2相互作用过程中起到至关重要的作用。（2）ROP18是唯一报道作为ROP5信号通路的上游分子，能够在宿主巨噬细胞内调控ROP5的表达水平，进而影响ROP5相互作用下游分子PKM2的表达水平。（3）ROP5可能通过PKM2介导下游分子STAT3、NF-Κb、Bcl-2、P53表达或活性变化，调控弓形虫抵抗宿主巨噬细胞凋亡的能力；ROP5、PKM2并没有影响THP-1细胞中H3 Histone的表达水平；ROP5能够引起Bcl-XL表达量上调，PKM2则不能。（4）利用小鼠体内实验也证实与对照组野生型弓形虫感染小鼠腹腔巨噬细胞相比，敲除ROP5弓形虫基因工程株腹腔巨噬细胞的凋亡能力明显高于对照组，说明弓形虫ROP5分子能够抑制宿主巨噬细胞早期凋亡。而且，敲除ROP5弓形虫基因工程株感染小鼠的存活时间明显高于野生型感染祖。本研究为弓形虫抑制宿主细胞的发生发展机制提供了新的线索和理论依据，并为其治疗提供了潜在的干预靶标。