基于CRISPR/Cas9技术研究弓形虫毒力因子ROP5的转录调控机制

Toxoplasma gondii is a widely distributed opportunistic protozoa，its infection has become a serious public health problem throughout the world. Rhoptry protein 5 (ROP5) is an important virulence factor of Toxoplasma gondii, but the regulational mechanism leading to virulence differences is still not clear. This study intends to utilize CRISPR/Cas9 system with cas9 nuclease and guide RNAs (gRNAs) to efficiently edit rop5 upstream sequence of the virulent and avirulent strains of Toxoplasma gondii (type I, type III) respectively, combining with in vivo and in vitro experimental methods of transient transfection, luciferase reporter system, Western-blot, infection of laboratory mice, to analyze the effects of the rop5-ups knockout, insertion both on the rop5 gene expression and virulence in mice, thus to clarify the transcription regulatory mechanisms of virulence factor ROP5, which will provide theoretical basis for finding new drug targets and vaccine candidate, and has important scientific significance for the prevention and control of toxoplasmosis.

弓形虫（Toxoplasma gondii） 是广泛分布的机会性致病原虫，其感染已成为严重的世界性公共卫生问题。棒状体蛋白5（ROP5）是弓形虫重要的毒力因子，但是导致毒力差异的调控机制仍不明确。本研究拟利用CRISPR/Cas9系统（包括Cas9核酸酶和引导RNA）对弓形虫强、弱毒株（I型、Ⅲ型）rop 5基因上游调控序列进行编辑，结合瞬时转染、荧光素酶报告系统、Western-blot、弓形虫攻击感染等体内、体外实验手段，系统分析弓形虫ROP5上游序列rop5-ups的缺失与插入对rop5基因表达及对小鼠毒力的影响，阐明rop5基因上游序列对ROP5的转录调控机制，为寻找新的药物作用靶点和疫苗候选分子提供理论基础，对预防和控制弓形虫病具有重要科学意义。

弓形虫（Toxoplasma gondii）是广泛分布的机会性致病原虫，其感染已成为严重的、世界性公共卫生问题。棒状体蛋白5（ROP5）是弓形虫重要的毒力因子，但是导致毒力差异的调控机制仍不明确。我们前期以弓形虫强弱毒株（Ⅰ、Ⅲ型）中的ROP5表达量差异为切入点，通过检索数据库和测序比对发现，Ⅰ型虫株（RH）rop5基因上游调控序列相比Ⅲ型弓形虫弱毒株（PRU）存在大量差异。我们预测分析该差异性可能是导致ROP5蛋白表达差异的原因。本项目拟利用CRISPR/Cas9系统敲除基因、萤光素酶、弓形虫攻击实验等手段系统分析弓形虫rop5基因上游序列对ROP5蛋白的表达调控机制及其对小鼠毒力的影响。结果发现：1、弓形虫（Ⅰ、Ⅲ型）强弱毒株rop5基因上游序列并进行比对，两者序列存在较多差异。2、成功制备ROP5单克隆抗体，能够识别弓形虫ROP5蛋白，不与培养细胞裂解蛋白起交叉反应。3、体外萤光素酶实验分析弓形虫强弱毒株（Ⅰ、Ⅲ型）rop5基因上游序列rop5-ups，发现两者-2kb上游序列转录活性相似，没有统计学意义。再分隔0.5kb片段序列检测中，各片段存在显著差异，具有统计学意义。4、成功构建弓形虫强弱毒株（Ⅰ、Ⅲ型）rop5基因上游序列rop5-ups及rop5基因三个CRISPR/CAS9基因敲除质粒。5、成功电转弓形虫虫株，测序验证获得弓形虫基因敲除株，同时观察到rop5-ups序列敲除对感染细胞噬斑形成具有形态学上差异性以及突变虫株在感染细胞中溢出能力明显下降。本研究为阐明ROP5蛋白表达的调控机制及其介导弓形虫强弱毒株毒力差异的作用，为寻找新的药物作用靶点和新的疫苗候选分子提供新的线索和理论依据，对弓形虫防治具有重要的现实意义。