杆状病毒AcMNPV p48基因的功能研究

杆状病毒p48基因是病毒复制的必需基因，对两种形式的病毒粒子：芽生型病毒（BV）和包埋型病毒（ODV）的形成均具有决定性的影响，该基因也是杆状病毒中首个发现的ODV囊膜形成所必需的基因，缺失该基因的病毒在感染的细胞中不能形成作为ODV囊膜前体的微囊泡。本项目拟以苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒（AcMNPV）的p48基因为研究对象，应用分子生物学、免疫电镜、免疫组织化学、酵母双杂交等技术和手段，构建带HA-标签的p48基因补回型重组病毒，利用该病毒分析P48蛋白在真核细胞中的表达时相以及在病毒粒子结构中的定位，同时利用酵母双杂交系统和免疫共沉淀技术，确定P48蛋白通过与病毒中的哪些蛋白相互作用来行使功能。深入研究p48基因的作用机理对揭示杆状病毒的复制与侵染机制，特别是病毒粒子的膜发生机制具有重要的意义，同时也为更好地利用杆状病毒防治害虫和构建遗传改良基因工程杆状病毒提供重要的理论依据。

本课题组的前期研究发现p48是杆状病毒复制的必需基因，该基因的缺失同时影响了杆状病毒两种形态的病毒粒子：芽生型病毒（BV）和包埋型病毒（ODV）的形成，尤其是阻断了ODV囊膜的前体—微囊泡的产生，这是在国际上首次发现ODV囊膜形成的必需基因。本项目以苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒（AcMNPV）的p48基因为研究对象，综合应用分子生物学、免疫电镜、免疫组织化学等技术和手段，成功构建了融合HA-标签的p48基因补回型重组病毒，在此基础上研究分析了P48蛋白在真核细胞中的表达时相以及在病毒粒子结构中的定位，首次在真核细胞中检测到P48蛋白的表达，发现该蛋白在病毒感染的晚期表达，表达后N-端可能被部分剪切，并且在感染后期可能发生进一步的剪切；利用P48蛋白融合的标签抗体进行的定位研究发现P48蛋白是杆状病毒的结构组分，同时定位在BV和ODV的囊膜和核衣壳上，免疫电镜定位分析进一步发现该蛋白在内核膜及微囊泡上均有分布。同时，本项目新发现了一个ODV囊膜形成的必需基因ac93，该基因的缺失引起的现象与p48极为相似，均同时影响BV和ODV的形成，并导致核衣壳不能穿出核膜和微囊泡无法形成，提示P48和Ac93可能相互作用影响内核膜向核质方向出芽形成微囊泡。蛋白相互作用分析发现P48与Ac93确实存在相互作用，此外，P48与ODV囊膜蛋白ODV-E25以及P48自身也存在相互作用。本项目的研究为揭示杆状病毒的复制与侵染机制，特别是ODV的膜发生机制提供了重要线索，而ODV膜发生机理的揭示将为更好地利用杆状病毒防治害虫和构建遗传改良基因工程杆状病毒提供重要的理论依据。