单颗粒病毒实时示踪方法研究杆状病毒AcMNPV转导不同组织来源人源细胞的机制

At present, Although gene therapy is used for clinical treatment of some diseases, the safety and effectivity of this technique remains to be promoted. One of the core technology of gene therapy is to acquire an safe and effective gene transfer vector. Baculoviruses are highly restricted insect viruses, which can enter, express foreign gene, but not replicate in mammalian cells, that supply the virus insurance for being used as gene transfer vector. However, mechanisms of baculovirus transduction are poorly understood, that limit its application in gene therapy to a large extent. To analyse the mechanism, we constructed SA-QDs and/or CFP labeled recombinant baculovirus AcMNPV by genomic engineering and chemical labeling, and then, by real-time tracking SA-QDs and/or CFP-labelled virus in cells originated from different human organs, we will focus on the following research questions: how and where does membrane fusion take place during virus entry (membrane fusion mechanism)? Which subcellular skeleton protien(s) and organ(s) participate in virus transportation within the cells (virus transportation machanism)? Where does virus release its DNA (DNA release site)? By elusidating the mechanisms above, this study will provide theoretical basis for development of gene transfer vectors, gene engineering cells and the applications of baculovirus in gene therapy.

目前，虽然基因治疗已经用于某些疾病的临床治疗，但是该技术的安全性和有效性仍有待进一步提升。基因治疗的核心技术之一是获得安全、高效的基因转移载体。杆状病毒是以节肢动物为唯一宿主的昆虫病毒，它可以侵入哺乳动物细胞，表达所携带的外源基因，但却不能在其中复制，这为将其用于基因转移的载体提供了可靠的安全保障。然而，杆状病毒转导哺乳动物细胞的具体机制尚不明确，这很大程度上限制了其在基因治疗上的应用。为了解析这一机制，项目组通过基因工程改造和化学标记等方法，成功构建了SA-QDs和/或CFP标记的重组杆状病毒AcMNPV，并拟利用此重组病毒转导不同来源的人源细胞，通过实时观察荧光的分离和运动轨迹来探索转导后病毒与宿主膜结构的融合途径、病毒粒子在细胞内的运动轨迹以及病毒核酸的释放位点，阐明杆状病毒转导哺乳动物细胞的机制，为推动并完善杆状病毒转基因载体和工程细胞的设计以及尽快实现临床应用提供重要的理论依据。

基因治疗的核心技术之一是获得安全、高效的基因转移载体。杆状病毒是以节肢动物为唯一宿主的昆虫病毒，它可以侵入哺乳动物细胞，表达所携带的外源基因，但却不能在其中复制，这为将其用于基因转移的载体提供了可靠的安全保障。然而，杆状病毒转导哺乳动物细胞的具体机制尚不明确，这很大程度上限制了其在基因治疗上的应用。为了解析这一机制，项目组通过基因工程改造和化学标记等方法，以杆状病毒为模型，建立出基于Spy-tag及Spy-catcher的量子点和GFP双标记新方法，并实时追踪，记录了杆状病毒囊膜与衣壳蛋白分离的过程。此外，建立同时动态示踪杆状病毒亲代/子代病毒实现病毒侵染复制行为的全程可视化示踪的技术平台。依据HaloTag在与不同配体结合时能发出不同颜色的光这一原理，通过反向遗传学技术将HaloTag与杆状病毒（AcMNPV)衣壳蛋白VP39融合表达，构建了嵌合有Halo Tag的重组杆状病毒rACMNP-VP39-Halotag，并rACMNP-VP39-Halotag感染细胞的不同阶段采用不同的配体对rACMNP-VP39-Halotag进行标记，根据重组AcMNPV在不同的激发光下所产生颜色的差异区别亲代病毒和子代病毒，利用基于共聚焦显微镜的单病毒示踪技术，完成了从重组AcMNPV吸附、入侵、病毒衣壳沿着微管运动与入核、子代重组AcMNPV在核内的组装、出核及在细胞质内的运动轨迹等病毒复制周期的全程单颗粒动态示踪。并在此基础上进行了重组AcMNPV对三种哺乳动物细胞的动态示踪。这些结果了阐明杆状病毒转导哺乳动物细胞的机制，为推动并完善杆状病毒转基因载体和工程细胞的设计以及尽快实现临床应用提供重要的理论依据。