复制可控型AcMNPV载体的开发及在鳞翅目昆虫基因功能研究中的应用

One of the most important impeding factors for molecular characterization of Lepidoptera is few high efficient research tools and methods being available. To solve this problem, this project will develop a recombinant AcMNPV vector, which will be able to carrying foreign genes for overexpression, RNAi mediated gene silence and protein epitope tagging, by controlling the expression of a replication essential gene for AcMNPV and making the replication of AcMNPV being controllable. Our previous studies showed that after replacing the original dnapol cassette, a virus DNA replication essential gene, with a Tet-on inducible expression one, replication of the recombinant AcMNPV could be induced by doxycycline in sf9 cells. We will then verify the controllable repliaction of AcMNPVs in Spodoptera exigua Hübner and Pseudaletia separate larvae, and check the RNAi effect on SechsA with the AcMNPV vector. With the success on constructing this recombinant AcMNPV vector, in combination with our on-going development of highthrough-put recombinant AcMNPV library construction, we will be able to make forward genetic screening on more than 30 species from Lepidoptera, thus build a good platform for functional genomics research on these species.

缺少高效的研究工具和方法，成为制约鳞翅目昆虫基因功能研究的重要因素之一。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）能经口感染30多种重要的鳞翅目害虫，对其复制必须基因进行改造，使病毒复制受人为调控，从而使AcMNPV成为能携带外源基因进行过表达、基因沉默和蛋白标记等的载体，将为鳞翅目昆虫基因功能研究提供一个高效工具。我们的前期研究证明，将AcMNPV复制必须基因dnapol置于诱导表达系统Tet-on的调控之下，能够在细胞水平实现AcMNPV的可控复制。在此基础上，我们将在甜菜夜蛾或黏虫个体水平验证病毒的可控复制，再通过对几丁质合成酶A的RNAi来检验重组AcMNPV介导基因沉默的效果。该病毒载体的成功开发，与本项目组正在进行的高通量AcMNPV病毒库构建技术相结合，将可在30多种鳞翅目昆虫中实现高通量正向遗传筛选，为这些昆虫的功能基因组研究提供一个好的平台。

基因功能的活体研究主要有两种手段，即过表达和敲除/沉默基因。而在鳞翅目昆虫中，过表达的手段几乎没有，而基因沉默的效果又不太理想。尽管近年来以CRISPR/Cas9的基因编辑技术能够高效产生基因敲除的昆虫，但其周期很长，有些必须基因还不能敲除。因而，开发一种鳞翅目中高效的研究工具很有必要。.本研究以苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）为材料，试图将其改造成一个复制受到控制，从而能够携带外援基因在鳞翅目昆虫中in vivo表达的工具。我们将其复制必须基因IE1敲除，然后通过Tet-on 3G系统再将这个IE1基因进行表达。具体通过两种方式，其一为直接将Tet-on 3G的两个元件，rtTA和TRE3G-IE1均插入AcMNPV病毒基因组上；其二为通过转基因的方式将rtTA基因稳定插入粘虫的染色体上，而将TRE3G-IE1插在AcMNPV基因组上。两种方式在细胞水平上表现都比较好；在虫体上，第一种有诱导效果，但仍然有一定水平的背景复制，即不加Dox诱导，仍然有一定水平的病毒复制，但通过一种化学药物abacavir，能够达到病毒可控复制的目的，使粘虫化蛹率达到85%，蛹感染率达到70%，羽化率达到55%以上。而通过第二种方式，无法实现病毒可控复制的目的。. 复制可控的AcMNPV可以携带外源基因（EGFP）在粘虫中过表达，我们同时探索了这种载体是否可以介导粘虫体内的RNAi，但结果表明，AcMNPV介导的RNAi在粘虫体内效果不稳定，这与我们通过直接注射dsRNA的效果一致，可见是粘虫本身对dsRNA介导的RNAi不敏感，可能与dsRNA的切割效率不高有关，下一步将探索用AcMNPV直接表达siRNA来进行基因沉默。既然AcMNPV可以介导外援基因的过表达，我们也将探究其携带CRISPR/Cas13来介导基因沉默的效果。