杆状病毒Ac76诱导核膜弯曲出芽的分子机理研究

Baculoviruses are important microbial insecticides. The occlusion-derived virion (ODV) of baculovirus is an important determinant factor for the insecticidal virulence and host range. ODV envelopes are derived from intranuclear membranes. So far, the mechanism by which the nuclear membrane buds into nucleoplasm to form the precursor of the ODV envelopes, so called intranuclear microvesicles, remains unknown. Vesicles result from the budding of the specific sites of membranes, and most of these specific sites are lipid raft microdomains. Meanwhile, the oligomerization of membrane proteins plays an important role during this process. Our previous study showed that the deletion of baculovirus conserved gene ac76 affects intranuclear microvesicle formation. Ac76 is an integral membrane protein and exists as a stable homodimer. It is localized to the plasma membrane, endoplasmic reticulum, nuclear membrane and intranuclear microvesicles. Bioinformatics analysis showed that Ac76 may form higher-order oligomers. So we propose a model in which Ac76 drives the bending and budding of lipid raft platforms to form intranuclear microvesicles via its oligomerization. In this project, we plan to demonstrate whether baculovirus infection is able to induce the formation of lipid raft on the inner nuclear membrane and whether Ac76 inserts into the lipid raft of nuclear membrane in the form of oligomer, and analyze the role that the oligomerization of Ac76 and the formation of lipid raft in the nuclear membrane play in the bending and budding of nuclear membrane. This study will shed important light on the understanding of ODV envelopment and benefit the genetic modification of baculovirus insecticides.

杆状病毒是一种重要的微生物杀虫剂，其包埋型病毒粒子（ODV）是杀虫毒力和宿主范围的重要决定因子，但ODV囊膜化的关键步骤——核膜内陷出芽形成核内微囊泡的机理至今未阐明。大部分囊泡是在膜的脂筏微区出芽，并需要蛋白寡聚化的驱动。我们的前期研究发现，杆状病毒保守基因ac76的缺失导致重组病毒无法产生核内微囊泡，Ac76蛋白是一个以稳定二聚体形式存在的整合膜蛋白，在感染细胞中定位于内质网、核膜、核内微囊泡等膜结构，生物信息学分析显示该蛋白可能形成更高级形式的寡聚体。据此，我们推测Ac76通过寡聚化驱动核膜的脂筏微区向核质出芽形成核内微囊泡。本研究拟通过分子生物学、病毒学和免疫组化等实验技术首次揭示杆状病毒诱导的内核膜脂筏形成以及Ac76的寡聚化，并分析二者与核膜弯曲出芽形成核内微囊泡的关系，以解析核膜弯曲出芽的生物学过程，为进一步阐明这种病毒的增殖机理并为遗传改良杆状病毒杀虫剂提供重要的理论基础。

杆状病毒的一个显著特征是在一个生活周期中可产生两种不同形态的病毒粒子，即从宿主细胞质膜出芽获得囊膜的芽生型病毒粒子，以及从核膜来源的核内微囊泡获得囊膜的包埋型病毒粒子（occlusion-derived virion, ODV）。ODV是杆状病毒杀虫剂的杀虫毒力和宿主范围的重要决定因子，但其囊膜化的分子机理未知，尤其是其中的关键步骤——核膜内陷出芽形成核内微囊泡的分子机理未知。我们的前期研究发现杆状病毒的保守蛋白Ac76在感染的细胞中可定位于核膜、核内微囊泡以及ODV囊膜，该蛋白是一个以稳定二聚体形式存在的整合膜蛋白，同时该蛋白存在潜在的胆固醇识别和作用模序，其编码基因的缺失可阻断核内微囊泡的形成。那么，Ac76是否通过寡聚化驱动核膜的脂筏微区弯曲出芽形成核内微囊泡呢？本项目首先检测病毒感染细胞中脂筏的分布，发现杆状病毒的感染能促使宿主细胞的内核膜形成脂筏，且在核内微囊泡以及ODV囊膜上也分布有脂筏，这是国际上首次在内核膜和核内膜结构上检测到脂筏结构。随后，我们分析了Ac76与脂筏的关系，发现Ac76为脂筏相关蛋白，与脂筏在核膜及核内微囊泡上存在共定位。Ac76在病毒感染的细胞中可形成高级形式的寡聚体。对Ac76进行系列截短和关键氨基酸的点突变，发现aa 70-84的缺失影响Ac76高级形式寡聚体的形成，同时也影响核内微囊泡的形成；其跨膜结构域中的三个亮氨酸L26、 L29 和L33的点突变影响Ac76在内核膜脂筏结构上的定位，同时也影响正常的核内微囊泡的形成，上述结果暗示Ac76的寡聚化及脂筏定位与核内微囊泡的形成密切相关。我们的研究结果为揭示核内微囊泡的形成机理提供重要的线索，同时也为全面阐释ODV的囊膜化机理奠定重要的理论基础。