骨桥蛋白磷酸化修饰对骨关节炎的影响及其调控机制

Osteoarthritis (OA) is a common geriatric disease. The mechanism of it is unclear yet. Applicants found that the expression of osteopontin (OPN) in human knee OA was significantly increased, which also had a correlation with the severity of the disease. But its specific role and mechanism are poorly elucidated. Given the importance of OPN phosphorylation in performing its function, it is assumed that change of phosphokinase level and phosphokinase site may change the ability of OPN to bind to cell surface receptor, which makes expression of many cytokines and matrix protein of chondrocytes altered, thereby influence the initiation and development of OA. The study will determine the discrepancy of phosphokinase level and phosphokinase site between OA cartilage and normal cartilage through phosphorylation mass spectrometry analysis firstly; then observe the ability change of mutant OPN bind to cell surface receptor by phosphoric sites-directed mutagenesis; next intervene normal chondrocyte via mutant OPN to investigate the expression alteration of MAPKs, MMP-13 in chondrocyte and metabolism change of cartilage matrix and discuss the functional difference of OPN which phosphorylate differently; finally analyse the diversity of OPN phosphorylate in OA chondrocyte using large number of samples,further establish the spectrum of OA-specific OPN phosphorylation. The aim of this study is to reveal the impact of OPN phosphorylation on the initiation and development of OA and its specific mechanism of regulation, so as to offer novel ideas for prevention and treatment of OA.

骨关节炎(OA)是一种常见衰老疾病，发病机理尚不明确。申请者研究发现骨桥蛋白（OPN）在膝OA中表达显著增高并与病变程度相关，但具体作用及机制尚不清楚。结合磷酸化在OPN功能发挥中的重要性，推测OPN磷酸化位点及水平改变使OPN结合细胞表面受体能力改变，致软骨细胞多种因子及基质蛋白表达变化，从而影响OA发生发展。本研究拟采用磷酸化质谱分析技术，明确OA软骨与正常软骨OPN磷酸化位点及水平差异；再采用基因定点突变技术突变相关磷酸化位点，观察突变型OPN结合细胞表面受体能力的改变；然后通过OA特异磷酸化修饰突变型OPN干预正常软骨细胞，观察软骨细胞MAPKs、MMP-13表达及软骨基质代谢的变化，探讨不同磷酸化修饰OPN的功能差异；通过分析大样本OA软骨OPN磷酸化修饰差异，进一步确定OA特异性OPN磷酸化谱。旨在揭示OPN磷酸化对OA发生发展的影响及其调控机制，为防治骨关节炎提供新思路。

骨关节炎(OA)是一种常见衰老疾病，发病机理尚不明确。申请者研究发现骨桥蛋白（OPN）在膝OA中表达显著增高并与病变程度相关，但具体作用及机制尚不清楚。结合磷酸化在OPN功能发挥中的重要性，推测OPN磷酸化位点及水平改变使OPN结合细胞表面受体能力改变，致软骨细胞多种因子及基质蛋白表达变化，从而影响OA发生发展。本项目从人OA软骨标本中分离培养软骨细胞。OA软骨细胞分为溶媒对照组（A组）、重组OPN干预组（B组）、体外磷酸化OPN干预组（C组），分别进行相应干预48h后，应用荧光实时定量多聚酶链反应（qRT-PCR）法检测各组中NF-κB及炎症相关因子mRNA表达情况；应用western blotting法检测各组中NF-κB及炎症相关因子蛋白表达情况；应用流式细胞术测定各组细胞凋亡情况，比较各组间差异。根据既往研究OPN潜在磷酸化位点的报道，并结合OPN分子中RGD序列、凝血酶以及基质金属蛋白酶裂解位点的特殊性质，选择该功能序列及裂解位点附近的五个潜在磷酸化位点T185，S195，S215，S234和S254作为本次研究备选位点；采用基因定点突变技术突变该5个磷酸化位点，构建5种突变型OPN基因慢病毒载体，并包装获得高滴度病毒后转染人软骨肉瘤细胞（SW1353），检测IL-1干预后MMP-13和IL-6的表达水平及细胞凋亡的变化。本课题研究发现与重组OPN相比，体外磷酸化的OPN显著增强OA软骨细胞NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6、MMP13、COX-2、iNOS表达，且显著增高OA软骨细胞凋亡率。野生型OPN转染SW1353细胞过表达后，促进细胞的增殖，并下调MMP-13和IL-6 mRNA的表达。T185、S195和S215位点突变后相比野生型OPN明显促进MMP-13、IL-6 mRNA和蛋白水平的表达，并抑制细胞增殖，同时T185、S195突变体还在一定程度上可以促进细胞的凋亡，提示T185、S195和S215可能为OPN对OA起保护作用的特异性磷酸化位点。本项目研究成果进一步明确了磷酸化修饰对OPN在OA中发挥作用的调节作用，明确了可能对OPN产生调节功能的磷酸化位点，揭示OPN磷酸化对OA发生发展的影响及其调控机制，为防治骨关节炎提供新思路。