OPN-N靶向结合α9β1调控相关细胞功能及其在骨关节炎中的作用与机理研究

Osteoarthritis (OA) is thought to be the most prevalent degenerative joint disease. The definite etiology and pathogenesis has not been illustrated clearly. We have found that thrombin-cleaved osteopontin (OPN-N) levels in synovial fluid are closely related to disease severity in the OA rabbit model. Combined with other literatures, we hypothesized that OPN-N might play a greater role than full length OPN (OPN-FL) in the pathogenesis of OA since the SVVYGLR sequence, exposed by thrombin cleavage of OPN-FL, may interact with α9β1 integrin expressed by chondrocyte, synoviocyte and osteoclast, which further regulates cellular function. This study aims to explore: 1) the differences of OPN-FL, OPN-N and α9β1 expression between OA patients and healthy people; 2) the effect of OPN-N in combination with α9β1 in regulating cell functions in vitro; 3) the protective and therapeutic effects of antibodies against OPN-N and α9β1 in vivo, through a series of methods including gene mutation and knockout, gene and protein detection and antibody intervention et al. This research attempts to reveal pathogenesis of OA, explore new therapeutic target, to provide some new ideas on the treatment of OA in the clinical practice.

骨关节炎(OA)是一种常见的关节退行性疾病，其发病机理尚不十分清楚，骨桥蛋白（OPN）是目前的研究热点之一。申请者以往的研究发现OA模型关节滑液中凝血酶裂解OPN（OPN-N）与OA严重程度密切相关。结合国内外其他文献，推测OPN-N较之完整的OPN（OPN-FL）在OA中有着更重要的作用，其机制可能是由凝血酶切割后暴露出的隐蔽抗原表位SVVYGLR结合软骨细胞、滑膜细胞与破骨细胞表面的整合素受体α9β1，从而影响相关细胞的功能。本研究拟通过体内体外实验，采用基因突变、基因敲除、抗体干预和基因蛋白检测等方法，比较OA患者与正常人相关组织和细胞OPN-FL、OPN-N、α9β1的表达水平及其与病程的相关性，验证OPN-N与α9β1结合从而调控相关细胞的功能，进一步探讨抗OPN-N或抗α9β1抗体对OA的防治效应。旨在从新的视角揭示OA的发病机理，探索新的生物学靶点，为临床防治OA提供新思路。

骨关节炎(OA)是一种常见的关节退行性疾病，其发病机理尚不十分清楚，骨桥蛋白（OPN）是目前的研究热点之一。结合国内外其他文献，推测 OPN-N 较之完整的 OPN在 OA 中有着更重要的作用，其机制可能是由凝血酶切割后暴露出的隐蔽抗原表位 SVVYGLR 结合软骨细胞表面的整合素受体 α9β1，从而影响相关细胞的功能。本项目比较了OA患者与正常人的软骨组织、滑膜组织中OPN-N表达水平的差异，结果表明OA滑膜中OPN-N较正常组升高，OA软骨中OPN-N较正常组升高。软骨标本行石蜡切片后行免疫组化检测结果表明OA软骨中OPN-N较正常组表达升高；课题组成功利用凝血酶在体外将全长的人重组OPN进行了裂解，获得了cleOPN。利用Western Blot验证裂解成功后用cleOPN干预了软骨细胞，通过qRT-PCR检测了白介素-6（interleukin 6, IL-6）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13, MMP-13）及多聚蛋白聚糖（aggrecan, AGG）mRNA的表达。发现cleOPN与全长的重组OPN相比，对软骨细胞IL-6、MMP-13的调控作用加强；课题组成功采用固相多肽合成法合成了精氨酸-氨基乙酸－天冬氨酸 （arginine-glycine-aspartate，RGD）结构基序和SVVYGLR结构基序，鉴定后干预人OA软骨细胞，通过qRT-PCR检测了IL-6、MMP-13及AGG mRNA的表达，结果表明RGD与SVVYGLR对软骨细胞的作用并不一致，SVVYGLR保护软骨细胞的潜力更大；课题组进一步通过细胞实验验证了cleOPN加用a9b1阻断抗体对软骨细胞的影响，发现a9b1阻断抗体可以阻挡cleOPN对软骨细胞二型胶原(Collagen 2，Coll2)表达的促进作用；课题组通过动物实验，利用手术进行了大鼠OA建模，探究了a9b1阻断抗体对软骨退变的影响，结果显示0.5ug/ml a9b1阻断抗体关节腔注射可显著减轻大鼠OA软骨损伤。通过上述研究，明确了凝血酶裂解这种翻译后修饰对OPN功能的调节作用，揭示了OPN裂解后暴露的SVVYGLR序列与整合素a9b1结合在OPN调控软骨细胞中的作用，为防治骨关节炎提供新思路。