骨桥蛋白调控骨关节炎软骨细胞和滑膜细胞自噬及其机制研究

Osteoarthritis (OA), the most prevalent joint disease, aging is one of the most important risk factors for OA. Autophagy is a cellular homeostasis mechanism for the removal of dysfunctional organelles and macromolecules. Autophagy is discussed as a novel avenue to delay joint aging and reduce OA risk.Our previous studies confirmed that not only OPN but also its receptors-integrin and CD44 all played important roles in OA.Taking together with others literatures ,we hypothesized that OPN could regulate chondrocytes’ and synoviocytes’ autophagy through the MAPK pathway via interaction with CD44 and intergrin . In this present study, first , it is to investigate the expression of OPN、integrin、CD44、MAPK and autophagy-related markers and to reveal their relationships, next, we will block the the possible involvement manners to confirm the former pathway was exciting,finally, we will construct the mice knee OA models to reconfirm that OPN could interact with integrin and/or CD44 and then active MAPK pathway to regulate chondrocytes’ and synoviocytes’ autophagy and so on. The purpose of this study is to reveal the mechanism of action, explore appropriate therapeutic approach , and also discussing the prevention and treatment aspects of OA .

骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病，年龄和衰老是最主要危险因素。自噬是细胞生物学领域的一个新研究热点，其具有抗衰老作用，可以延缓和治疗关节老化及OA进展。我们既往研究发现骨桥蛋白（OPN）及其受体 integrin、CD44都参与了OA病程进展。结合国内外文献最新进展，申请人推测：在OA中， OPN通过与integrin和CD44结合激活细胞内MAPK通路后刺激细胞自噬活性改变从而调节细胞生物学性能。本研究拟首先比较正常人和OA患者 OPN、integrin、CD44、MAPK标志物和自噬标志物的表达并验证其关联性。再在体外培养软骨细胞和滑膜细胞，分别阻断上述传导路径后检测相关标志物的变化，验证上述路径在OA中的作用。最后构建OA小鼠模型，进一步证实：OPN与integrin/CD44结合后激活MAPK信号通路进而调控细胞自噬，并探究可能的最佳干预靶点，为预防和治疗OA提供新思路。

在项目执行过程中，项目申请人首先成功构建了体外的软骨细胞和滑膜成纤维样细胞OA模型， 采用重组OPN干预细胞，再阻断OPN与其受体CD44和αvβ3 integrin的结合后，检测了自噬标志物becllin 1和LC 3 以及MAPK 通路相关蛋白的表达，然后，采用MAPK通路的特异性抑制剂干预细胞并检测自噬水平变化；在此基础上，构建OA细胞模型的LC3双标腺病毒转染体系，采用共聚焦显微镜观察了解细胞体内自噬的变化，然后，采用流式细胞术检测了OPN对软骨细胞凋亡的影响，最后，采用CCK-8检测了相关试剂对细胞增殖及活性的影响。上述研究显示：OPN 可以下调软骨细胞 beclin1 和 LC3 的蛋白表达水平（p<0.05），阻断 OPN-CD44 或OPN-αvβ3 integrin（CD51/61）的结合可以部分抑制 OPN 的下调作用（p<0.05）；在予以 OPN 干预软骨细胞后， pERK/ERK 的比值显著升高（p<0.05），而p38 和 JNK 则无明显改变（p>0.05），说明ERK MAPK 信号通路参与了 OPN 抑制软骨细胞自噬的过程，而予以ERK 特异性抑制剂可以部分阻断 OPN 对软骨细胞自噬的下调作用，但是流式细胞术显示OPN对软骨细胞的凋亡并无明显的改变（p>0.05）。同时，采用LC3腺病毒转染软骨细胞后共聚焦显微镜下观也证实了OPN对软骨细胞自噬的下调作用。因此， OPN 可以通过与 CD44 和 αVβ3 integrin 的结合抑制软骨细胞自噬水平， ERK MAPK 信号通路也参与这一过程。同样，在滑膜细胞中也发现OPN 可以下调细胞 beclin1 和 LC3 的蛋白表达水平（p<0.05），阻断 OPN-CD44 或OPN-αvβ3 integrin（CD51/61）的结合可以部分抑制 OPN 的下调作用，采用LC3腺病毒转染滑膜细胞后共聚焦显微镜下观也证实了OPN对滑膜成纤维样细胞自噬的下调作用。CCK-8的结果则显示予以OPN干预后，软骨细胞和滑膜细胞的活性较空白组显著增强。上述结果显示OPN在OA的病理进程中发挥着复杂的作用，OA中高表达的OPN不仅可以作为生物学标志物也可能可以作为早期治疗OA的干预靶点但仍需要进一步研究。