落叶松干细胞发育关键MicroRNAs功能分析及其TALEN定向突变体创制

This project focuses on the formation mechanism of desirable qualities in forestry. To identify the biology mechanism and expression of critical MicroRNAs at Pro-Embryogenic Mass (PEM) development and Somatic Embryo (SE) formation, we will create over-expression and miRNA suppression system to enhance or depress the expression of critical microRNAs which plays a key role during the somatic embryo development, by our somatic embryo development system; create knockout mutant by Transcription Activator-Like Effectors Nuclease (TALEN)-mediated gene targeting method. The biology function of miRNAs will be identified by characterization of transformed-proembryo in larch.The mechanism will be revealed by miRNA techniques in the following fields: (1) Biological function and regulation of critical miRNAs which related with embryogenicity development; (2) Regulation for pre-embryo cell lines development from PEM（I-III）to SE after ABA induction or NPA inhibition. (3) Regulation for abnormal pre-embryo development from SE to mature SE. This project will addresses some fundamental molecular questions in growth and development for tree, mechanism of miRNAs in breeding by embryogenic cell lines and formation of desirable qualities in afforestation species.

围绕林木优良性状形成的生物学基础，在建立了落叶松干细胞发育模式的基础上，针对其特有的PEM发育循环与SE形成时关键的miRNAs表达特性，根据上一项目发现的干细胞发育相关miRNAs，建立关键miRNAs前体的过表达及反义表达体系，增强或抑制这些在关键环节高度表达的miRNAs；引入TALEN技术，进行定向突变体创制。通过落叶松干细胞原胚转化检测体系，鉴定这些miRNAs的生物学功能。在miRNA水平上揭示：（1）干细胞胚性获得相关MiRNAs功能验证及调控机制；（2）PEM（I-III）到SE，ABA（正向）或NPA（抑制）调控原胚发育分子机理；（3）从SE到 mature SE的成熟过程中，畸形胚发生原因及正常胚调控机制。从而在分子水平上综合探索树木生长发育规律，阐释MiRNAs在干细胞品种化繁育中的调控机制，揭示造林树种优良性状形成的生物学基础，具有重要的理论意义。

针对已经发现大量与落叶松人工胚胎发育相关miRNAs的基础上，通过建立关键miRNAs前体的过表达及反义表达体系，增强或抑制这些在关键环节高度表达的miRNAs；进一步引入TALEN技术，进行定向突变体创制。通过成功的干细胞原胚转化检测体系，鉴定这些miRNAs的生物学功能，从而研究其在干细胞发育过程中的调控机理。（1）通过筛选落叶松易转化细胞系，优化侵染方式和脱菌工艺，建立了高效落叶松转化体系标准，同时检测了落叶松转基因阳性细胞系中外源基因的表达情况；（2）成功实施了落叶松关键miRNAs的转化、再生及功能研究，研究结果表明：miRNA156超表达显著提高落叶松成胚率；miRNA166a通过目标基因HD-ZIP Ⅲ间接调控IAA信号途径，影响落叶松体细胞胚发育及其萌发过程；miR396通过目标基因GRF影响体细胞胚子叶与根端发育；（2）深度挖掘了体细胞胚发育进程中ABA响应的20个关键差异表达基因；筛选了胚性/非胚性转换相关差异表达的26个miRNAs及其对应的71个靶基因；分析了体细胞胚同步化发育相关的sncRNAs，发现24nt sRNAs在同步胚和非同步胚中均高度表达；而同步胚胎中，大多数为24nt sRNAs，其可能通过抑制分化促进因子的早熟表达，从而调节体细胞胚的同步化发育；鉴定了富氢培养的相关的96个差异表达miRNAs。（4）完成了TALEN、CRISPR-Cas9组装文库构建，快速基因分型体系构建；完成了高效单一转录单元CRISPR-Cas9（single transcript unit CRISPR-Cas9, STU-Cas9）定向编辑系统的设计及构建；构建了简单、高效、特异的多样化植物CRISPR-Cas12a基因组编辑新系统；针对植物microRNA基因编码位点实现了有效编辑，并对其编辑特性进行了解读；针对CRISPR-Cas介导的植物基因组编辑脱靶效应进行基因组尺度解读。本项目通过关键 miRNAs的功能研究，发现并诠释 MiRNAs 在干细胞品种化繁育中的调控机制，揭示了造林树种优良性状形成的生物学基础。