槐耳突变体多糖合成关键基因的克隆及其功能分析

槐耳多糖作为处方药，具有促进巨噬细胞功能、调节细胞免疫功能、抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡等独特药效而备受关注，申请者以多糖抗肿瘤效果显著、完全拥有自主知识产权的槐耳新菌株T19、槐耳多糖合成量显著增加的突变体T191和多糖合成量显著减少的突变体T389为典型试验材料，拟采用双向电泳、质谱等高通量蛋白质组学技术，寻找参与槐耳突变体多糖合成的相关差异蛋白，并对差异蛋白进行质谱分析，得到肽质量指纹图谱，阐明差异蛋白质氨基酸序列等信息；根据其序列利用RT-PCR和RACE方法克隆参与槐耳突变体多糖合成的候选基因；研究不同发酵条件对槐耳菌丝体多糖合成的影响及候选基因mRNA转录模式，进一步通过原核和真核表达筛选、鉴定关键基因，并验证其在多糖合成中的作用，为进一步研究槐耳多糖合成关键基因的调控机理、高效表达以及最终实现槐耳菌株的定向进化升级改造、提高多糖产率提供理论依据。

槐耳学名槐栓菌(Trametes robiniophila Murr.)，是一种珍稀的药用菌，本研究以多糖抗肿瘤效果显著的槐耳新菌株T19、槐耳多糖合成量显著增加的突变体T191和多糖合成量显著减少的突变体T389为典型试验材料，采用双向电泳、质谱等高通量蛋白质组学技术，寻找参与槐耳突变体多糖合成的相关差异蛋白，并对差异蛋白进行质谱分析，得到肽质量指纹图谱，阐明差异蛋白质氨基酸序列等信息。为进一步研究槐耳多糖合成关键基因的调控机理、高效表达以及最终实现槐耳菌株的定向进化升级改造、提高多糖产率提供理论依据。.1、参与槐耳突变体多糖合成蛋白的差异表达分析.建立了槐耳菌丝体全蛋白双向电泳新体系；通过对T19、T191和T389菌丝体蛋白双向电泳结果分析，得到了表达量差异倍数在3.0以上的蛋白点20个。对这20个蛋白点进行质谱分析，经鉴定其中有18个蛋白有质谱信号，在NCBInr-Fungi数据库搜索之后，其中14个蛋白得到鉴定，3个蛋白为假定蛋白，还有1个未知蛋白。.2、槐耳突变体多糖合成相关基因的克隆及原核表达.利用RT-PCR和RACE-PCR技术成功克隆了6个基因，分别为果糖二磷酸醛缩酶、烯醇化酶、尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶、果糖-1,6-二磷酸酶、无机焦磷酸酶和UDP-葡萄糖脱氢酶基因，构建了原核表达载体，结果显示，pET-28a-c(+)/FBAase融合蛋白的分子量约为40KDa，pET-28a-c(+)/Enolase融合蛋白的分子量约为47KDa，与预测结果相吻合，确定实现目的蛋白的原核表达。.3、槐耳多糖合成相关的FBPase基因转化体系的建立.通过构建含香菇gpd启动子的表达载体，建立了农杆菌介导的转化体系，成功将果糖-1,6-二磷酸酶的基因成功转入了香菇。.4、转化子多糖含量的测定.通过液体发酵试验，测定槐尔果糖-1，6-二磷酸酶基因香菇转化子中多糖含量的变化，较对照组提高14-26%。