莱茵衣藻ACP相互作用蛋白的分离及其油脂代谢相关功能解析

Microalgae as producers of biodiesel precursor has the greatest potential for the raw material of clean and renewable energy sources. It has important significance to research the key enzymes related to lipid biosynthesis in microalgae and cultivate rich-lipid microalgae. Acyl carrier protein (ACP) is a crucial factor in plant fatty acid synthetase and participates in many reactions in fatty acid synthesis as an important co-factor. But the mechanism of lipid biosynthesis has been understood poorly so far. This project will study the proteins interacting with ACP in Chlamydomonas reinhardtii by proteomics and reverse genetic manipulation. The kinds and the relevance to lipid biosynthesis of proteins interacting with ACP will be identified when cultures are grown for 0hr, 6hr, 12hr and 24hr in N-deprived conditions through a series of methods, such as tandem afinity purification (TAP), Mass Spectromotry (MS), artificial microRNA (amiRNA) interference, Real-time PCR. We will analyze the changes of mRNA expression level of ACP-interacting proteins to determine if the changes are caused on transcriptional level also. These results will provide evidence for clarifying the mechanism of lipid biosynthesis in rich-lipids microalgae and establish a basis for creating rich-lipids microalgae strains by gene engineering manipulations.

产油微藻是目前公认最具潜力的再生清洁能源原料，研究微藻油脂合成关键酶，培育高产油微藻株意义重大。酰基载体蛋白（ACP）是植物脂肪酸合成酶系的关键蛋白，包裹在脂肪酸合成酶复合体的最中心。ACP参与着植物脂肪酸合成的多个反应，但迄今为止，莱茵衣藻的油脂合成机理还不够明确。本研究拟以莱茵衣藻的ACP为研究对象，综合蛋白质组学与反向遗传学的方法，首先构建融合串联亲和标签的ACP转基因莱茵衣藻，然后通过质谱鉴定、人工微RNA干扰、荧光定量 PCR等技术，研究分别在缺氮0、6、12、24小时，衣藻体内与ACP相互作用的蛋白，明确衣藻油脂合成过程中ACP相互作用蛋白的种类及其与油脂代谢的相关性，并通过分析ACP相互作用蛋白的mRNA表达量的变化，判断其变化是否由转录水平引起。本研究将为阐明富油微藻油脂合成机制提供依据，并为通过基因工程手段构建高产油藻株奠定基础。

生物柴油因其生物降解性好、无毒、可再生等特点，被认为是最具潜力、能实现可持续供给的油脂生物质资源之一。产油微藻不仅产油量高、生长周期短、而且环境友好、“不与粮争地，不与人争粮”，因此是目前被公认最具潜力的再生清洁能源原料。虽然微藻生物柴油技术目前已经取得长足进步，但是要降低生产成本，获得生长快速、含油量高的微藻藻种是解决这一问题的关键。因此，研究微藻油脂合成关键酶，培育高产油微藻株意义重大。但迄今为止，莱茵衣藻的油脂合成机理还不够明确。酰基载体蛋白（ACP）是植物脂肪酸合成酶系的关键蛋白，包裹在脂肪酸合成酶复合体的最中心。在合成脂肪酸的过程中，ACP参与着植物脂肪酸合成的多个反应，它作为载体将酯酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应。因此，弄清微藻中ACP蛋白复合体的组分及各组分在油脂合成中的功能，将有助于人们进一步弄清微藻产油机理，为进一步通过基因工程手段获得高产油微藻株奠定基础。本研究主要以莱茵衣藻的酰基载体蛋白家族两个成员之一——ACP1为研究对象，综合蛋白质组学与反向遗传学的方法，首先构建融合串联亲和标签的ACP1转基因莱茵衣藻，然后通过质谱鉴定、人工微RNA干扰、荧光定量 PCR等技术，研究分别在缺氮0、6、12、24小时，衣藻体内与ACP1相互作用的蛋白，明确衣藻油脂合成过程中ACP1相互作用蛋白的种类及其与油脂代谢的相关性，并通过分析ACP1相互作用蛋白的mRNA表达量的变化，判断其变化是否由转录水平引起。另外，本研究还研究了干扰莱茵衣藻淀粉代谢途径相关基因的表达对其油脂积累的影响。本研究将为进一步研究莱茵衣藻油脂形成机理打下良好基础，并最终为通过基因工程手段构建高产油藻株提供理论依据。