莱茵衣藻缺铁应答调控基因femu2p功能解析

铁是生物体十分重要且必不可少的元素，铁的缺乏和过量都将造成机体代谢失调，所以细胞必须具备一套严格的调控机制调节铁的同化和代谢，维持铁稳态。通过上一个国家自然科学基金项目"莱茵衣藻缺铁应答缺陷突变体构建及功能分析"的研究，筛选得到一个突变体mu2，已经确认mu2的缺失基因femu2p在缺铁应答调控中的重要作用。通过生物信息学分析，显示Femu2p蛋白含有C2H2锌指结构域和泛素连接酶E3 RING-finger 结构域。本研究拟对Femu2p锌指功能域、E3 RING-finger功能域进行功能诠释。同时通过Femu2p在莱茵衣藻中过量表达及femu2p基因的表达模式和亚细胞定位的研究，以阐明该基因在缺铁信号应答及信号转导过程中所处网络关系的位置，以及在缺铁信号应答调控中发挥的作用。

利用两次重叠延伸PCR的方法扩增了Femu2p的全长编码区序列(CDS)，基因CDS序列全长2904bp, ，编码967个氨基酸，理论分子量为100.4 kDa，理论等电点为8.86。构建了C2H2-GST融合表达载体，并获得了可溶的融合蛋白。随后对GST-C2H2融合蛋白进行一步亲和纯化，获得大小为35.4KD的目的融合蛋白。GST-C2H2融合蛋白在寡聚核苷酸库中筛选到37条与融合蛋白稳定结合的DNA序列。其中81%包含核心的TGGG/T序列。随后对核心序列进行碱基突变，结果表明位于核心序列第三第四位的碱基是非常重要的，GST-C2H2突变之后，融合蛋白无法与DNA结合。利用酵母双杂交技术筛选了与C2H2功能区结合的靶蛋白，共获得24个有效序列。.构建了Femu2p-pCambia1302过量表达载体，转化莱茵衣藻CC425。利用real-time PCR检测藻株内Femu2p基因的mRNA丰度，结果表明，不论是+Fe条件，还是-Fe条件下，过量表达转基因藻株中Femu2p基因mRNA丰度均比对照升高。特别是在-Fe条件下，转基因藻株Femu2p-10内的基因mRNA丰度比对照提高了100多倍。利用realtime PCR检测转基因藻株五个缺铁应答相关的基因FOX1、Fea1、ATX1、Nramp2和Ftr1的mRNA丰度，结果显示，在-Fe条件下，ATX1、Nramp2、Fox1和Fea1的表达量比+Fe条件下的表达量高，但与-Fe条件下的对照相比，过量表达的转基因藻株中，Ftr1、Nramp2、Fea1的表达量有所下降。ATX1、FOX1变化不明显。与转空载体pCambia1302的对照藻株相比，-Fe条件下，Fv/Fm值两者之间差异不大，过量表达的转基因藻株细胞密度比对照增加。.随后对Femu2p启动子序列进行了分析，扩增了Femu2p ATG翻译起始位点上游1107bp和下游117bp之间的序列，全长1124bp。将Femu2p启动子序列连接至载体pJD100，转化莱茵衣藻CC425。对转基因藻株在-Fe、-Cu、高温、低温、NaCl处理等条件下，检测ARS活性，结果表明15个转基因藻株在NaCl处理下显蓝色。随后对ARS活性进行定量分析，结果也表明，含启动子序列的转基因藻株ARS活性显著升高，其对应的ARS基因mRNA丰度也随之显著上升。