hFIXm-Fc融合基因修饰间充质干细胞治疗血友病B小鼠的研究

Hemophilia B is a hemorrhagic hereditary disease characterized by the single gene deletion of clotting factor IX (FIX). The current treatment for hemophilia B is based on replacement therapy using plasma derived or recombinant FIX. Hemophilia B patients require frequent intravenous injections of FIX products through their lifetime. Gene therapy is a promising option for curing hemophilia B, but the low expression level affects its therapeutic outcome. This project aims to use mutant hFIX(hFIXm) fusion express with the FC fragment to simultaneously increase hFIX activity and half-life, thus improve the low expression level of FIX in current gene therapy in treating hemophilia B. We will firstly transfect the MSCs of hemophilia B mice with lentivirus expressing hFIXm-Fc gene. Then, we will inject the modified MSCs back to hemophilia B mice to evaluate the therapeutic effects. We will apply the technologies of cell biology, molecular biology, and hematology to demonstrate the feasibility of in vivo expression of hFIX-FC fusion protein on individual animal level. We will analyze the in vivo expression level, distribution, bioactivity and half-life of hFIX-Fc protein. All these efforts will demonstrate the feasibility and safety of in vivo expression of hFIX-FC fusion protein for gene therapy. We will evaluated the beneficial effect of hFIX-FC fusion protein by setting the negative control group (MSCs of hemophilia B model mouse with lentivirus expressing wild type hFIX gene). This will demonstrate MSCs transfected with lentivirus expressing hFIXm-Fc gene can improve the in vivo expression level of FIX. This project will also provide theoretical and technical foundations for applying FC fusion expression in gene therapy and exploring new therapeutic approaches of hemophilia B.

血友病B是凝血因子IX（FIX）单基因缺失引发的遗传性出血性疾病，临床上主要以FIX替代治疗为主，患者需终身频繁输注FIX制品。基因治疗为血友病B提供了一种治愈可能，但常因FIX表达水平低影响治疗效果。本申请拟利用突变型人凝血因子IX与Fc片段（hFIXm-Fc）融合表达的方法，同时增加FIX活性与半衰期，以改善血友病B基因治疗中FIX表达水平低的现状。我们拟用hFIXm-Fc融合基因修饰的血友病B小鼠骨髓间充质干细胞对血友病B小鼠实施治疗，综合应用多种技术，检测hFIXm-Fc融合蛋白在治疗小鼠体内的表达、分布、生物活性和半衰期等指标，评价hFIXm-Fc融合基因用于基因治疗的可行性；并与野生型hFIX基因相比较对血友病B小鼠表型的改善作用，分析hFIXm-Fc融合基因是否增加FIX的表达水平。本研究将为Fc融合表达应用于基因治疗和血友病B基因治疗新策略的探索提供理论与技术基础。

血友病B是凝血因子IX（FIX）单基因缺失引发的遗传性出血性疾病，患者需终身频繁输注FIX制品进行治疗。基因治疗为血友病B提供了一种治愈可能，近些年取得了长足进展，但仍存在一些问题。研究表明，人体对腺相关病毒载体（AAV）的免疫反应显著影响基因治疗疗效，因此在保证外源基因高表达的情况下降低病毒载量是改善基因治疗的关键。本研究目标是利用融合蛋白表达技术，实现长效FIX融合蛋白的在体表达，通过增加FIX血浆半衰期来改善血友病B基因治疗效果。.我们首先构建了融合表达在体，并进行了细胞水平表达验证，随后制备FIX-Fc融合表达转基因小鼠，研究融合蛋白在体表达的安全风险。结果显示，乳腺特异表达FIX-Fc融合蛋白，可在乳汁中得到高凝血活性、高比活的融合蛋白，且对转基因动物健康状况未见明显影响。该发现证实可实现融合蛋白的在体表达，且具有显著应用价值，已申请专利。但在制备FIX-Fc全身表达小鼠时，我们发现Fc融合表达有一定胚胎毒性，对血友病治疗可能存在潜在影响。因白蛋白融合表达也是常用的延长目标蛋白半衰期的方法，我们随后构建了FIX和白蛋白（HSA）的融合表达载体（hFIX-HSA），并进行了体内外的表达验证。与Fc融合表达不同，可得到乳腺特异和全身表达FIX-HSA融合蛋白的阳性转基因小鼠，并实现FIX-HSA融合基因高效表达，且无显著的安全风险。.证实白蛋白融合表达的安全性后，我们利用FIX-HSA融合表达质粒对血友病B模型小鼠进行了治疗研究。结果显示，相比对照质粒，在体表达HSA融合蛋白显著增加FIX活性水平，并显著改善模型小鼠的出血症状，具有潜在的应用价值。因此，我们制备了相应AAV病毒载体对模型小鼠进行治疗研究，初步结果显示，融合表达效果更优，但整体治疗效果暂未达到文献报道水平，后续还需进行病毒载体优化使其适于现有体系。.综上，利用融合蛋白在体表达技术提高FIX血浆半衰期，具有改善血友病B基因治疗疗效的潜力，且未见显著安全风险。现有研究结果为融合表达应用于基因治疗及血友病B基因治疗新策略的探索提供了一定的理论与技术基础。