益生菌Ⅱ型拓扑异构酶基因QRDR变化与耐药性的相关性

本课题在对内蒙古牧区具有民族特色的乳及乳制品中的有益乳酸菌进行分离鉴定及其生物学特性研究、耐药性筛选的基础上，选择了具有优良特性、适用于实际生产的双歧杆菌属和植物乳杆菌属的菌株作为试验菌株，对其进行Ⅱ型拓扑异构酶基因氟喹诺酮耐药决定区（quinolone resistance determining region，QRDR）变化与其耐喹诺酮药相关性的研究，旨在探明氟喹诺酮类抗菌药耐性试验菌株Ⅱ型拓扑异构酶中DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因QRDR特征，在基因水平上研究这些试验菌株对喹诺酮类抗菌药的耐性机理，为试验菌株在药品、食品的开发和利用中的安全方面提供试验数据，同时，也为工业化生产提供安全、优良的双歧杆菌和植物乳杆菌菌株。

为探明耐氟喹诺酮类抗菌药的有益乳酸菌Ⅱ型拓扑异构酶QRDR中的基因特征，并在基因水平上研究其耐药机理，为其在食品、药品的开发和利用中提供安全方面的试验数据，同时为工业化生产提供安全、优良的乳酸菌菌株。本项目选择了对人和动物机体有益的生理性细菌和在临床医学上素有“后起之秀”之称的氟喹诺酮类抗菌药作为研究对象，进行了有益乳酸菌耐氟喹诺酮类抗菌药特性及机理研究。.　　对内蒙古牧区具有民族特色的乳及乳制品中的83株有益乳酸菌进行分离鉴定及生物学特性研究，通过形态学、生化特性及16S rRNA序列分析鉴定，结果表明试验菌株中有 Enterococcus raffinosus，Enterococcus durans，Lactobacillus plantarum等。.　　采用牛津杯法和试管两倍稀释法对试验菌株进行了耐药性测定，发现其对诺氟沙星和环丙沙星具有不同程度的耐药性。另外，通过对比3种方法对氟喹诺酮类药物的敏感性检测，结果表明3种方法标准差平均值：打孔法＜牛津杯法＜纸片法，说明打孔法试验的误差最小、准确度更高。打孔法更适用于乳酸菌对氟喹诺酮类药物的敏感性检测。.　　根据NCBI Genbank中公布菌株的Ⅱ型拓扑异构酶基因序列，利用软件Primer5进行引物设计。试验通过对菌株II型拓扑异构酶gyrA和parC 基因进行PCR扩增及测序，并与敏感性菌株进行突变位点的比较，发现耐氟喹诺酮类抗菌药乳酸菌的gyrA部分基因位点发生突变，parC基因的突变位点很少。.　　用碱裂解法对耐药菌株进行质粒的提取，将得到的质粒转化至感受态细胞DH5α并进行转化菌株耐药表型的分析。试验菌株对两种氟喹诺酮类药物均呈现较高耐药性，但均未能提取出耐药质粒；对耐药菌株基因组DNA进行转化试验，未能鉴定出其耐药性。.　　本课题的研究成果不仅在生产实际中可以将有益乳酸菌微生态制剂与氟喹诺酮类抗菌药制剂同时使用以维持肠道正常菌群，并用于肠道感染的治疗与恢复。更重要的是乳酸菌的自然耐药性特征可以作为抗生素治疗的选择依据，它可以极大地扩大微生态制剂的应用范围，在理论上为微生态制剂应用科学填补新的内容。从另一方面，为选择没有或含有尽可能少的可转移耐药因子的有益乳酸菌作为发酵食品和活菌制剂的菌株以及避免耐药因子的传递提供理论依据和测定方法。