铜绿假单胞菌耐药性与III型分泌系统的相关性研究

III型分泌系统（TTSS）是铜绿假单孢菌编码的重要致病因子，临床研究发现，TTSS显著地影响铜绿假单孢菌感染的结果，与患者的发病率和死亡率密切相关。我们在前期研究中首次发现，抗菌素泵出系统mexE-mexF-oprN的负调节因子MexS,参与调节TTSS的表达，该抗菌素泵出系统是铜绿假单孢菌对多种抗菌素产生耐药性的主要原因。本项目主要内容是，研究抗菌素泵出系统与TTSS之间存在的遗传调节机制，初步建立相应的调控模型；在此基础上，本项目拟对临床分离的铜绿假单孢菌菌株开展研究，分析各菌株中TTSS的表达水平、抗菌素耐药性和相应的遗传背景，对上述建立的调控模型进行验证与补充。本项目的研究结果，有助于发现铜绿假单孢菌新的靶位基因，对于发展新型疫苗和治疗途径、解决细菌耐药性等问题，都具有非常重要的理论意义和临床应用价值。

铜绿假单胞菌编码多种重要致病因子，同时也存在多种耐药性机制。本项目的目的是探索致病因子III型分泌系统（type III secretion system, TTSS）与RND抗菌素外排泵的关系。.通过构建TTSS高表达菌株PAK的染色体基因文库，发现菌株PAK编码的RND外排泵MexEF的负调节因子MexS，能够显著提高PAO1菌株TTSS的表达水平；MexS表达依赖于LysR类型转录调节因子MexT的调控，同时调节MexT的表达，二者均参与TTSS的表达；序列分析发现PAK与PAO1中的MexT为活性蛋白，而PAK中的MexS为缺陷蛋白。综上，MexS的作用机制为抑制TTSS的表达，其在PAK中为缺陷蛋白，导致抑制作用消失；导入PAO1中干扰正常MexS蛋白的抑制作用，部分提高PAO1菌株的TTSS表达。进一步分析MexT抑制TTSS表达的调控途径，发现基因PA2486编码的小蛋白PtrC，其过表达能够抑制TTSS，该基因缺失不影响TTSS表达；而在mexT突变子中过表达MexS蛋白能够单独完全抑制TTSS的表达。结果显示，MexT抑制TTSS的表达存在两种调控途径。另外，过表达正常MexS蛋白，不影响MexT控制的其它基因的表达，包括MexEF外排泵、弹性蛋白酶和绿脓素，显示存在不同的调节机制。本项目建立了关于MexS与MexT调节TTSS、MexEF外排泵、弹性蛋白酶以及绿脓素表达的理论模型。.对于收集的铜绿假单胞菌临床菌株进行了相关性分析。通过构建主要RND外排泵、TTSS调节基因exsA与毒素基因exoT启动子的融合报告基因，对相关基因表达水平进行研究。统计学分析表明， TTSS表达与外排泵MexCD表达具有正相关性（P<0.05）；与菌株亚胺培南耐药性具有负相关性（P<0.05）；与呼吸道感染等临床症状相关（P<0.05）；与取标本时间相关（P<0.05）；调节基因exsA表达与基因exoT表达存在正相关（P<0.001）。另外，进一步分析了主要RND外排泵启动子融合报告基因的表达水平与β-内酰胺类抗生素耐药性间关系。结果发现MexAB、MexCD和MexXY的表达水平与其耐药性存在显著相关性（P<0.05），MexAB对临床菌株β-内酰胺类抗生素耐药性具有主要影响。最后，还研究了亚胺培南抗性菌株的相关耐药机制，发现部分菌株oprD基因被插入片段阻断，