基于核酸信号扩增的基因突变数字化检测新方法研究

Digital PCR is an important method for gene mutation detection due to its highly sensitive and accurately quantitative detection. However, digital PCR is based on template amplification, which usually causes cross-contaminations from amplicons, leading to false positive results. We proposed a novel strategy to develop digital detection of nucleic acid by using signal amplification of nucleic acid instead of template amplification. Based on our previous study on developing signal amplification methods for gene mutations detection by using invasive reaction, we will firstly establish a new method based on an inertial microfluidic chip for preparing uniform digital reaction units, each of them contains only one bead for signal amplification. Then, we will develop a cascade invasive reactions, which can efficiently and specifically amplify the signals specific to one copy of mutated target in a digital reaction unit. By using a universal fluorescence probe to report the bead with positive reaction, the mutated targets can be digitally quantified via counting the fluorescence-positive beads and the fluorescence-negative beads by using a flow cytometer. Our method overcomes the amplicons cross-contaminations of digital PCR, opens a new way to develop digital detection methods for gene mutations, and provides a new powerful tool for clinical detection of gene mutation biomarkers.

数字化PCR因其灵敏度高、定量准确而成为基因突变检测的重要手段，但由于采用模板扩增原理使其易受到扩增产物交叉污染的影响，产生假阳性结果。本课题创新性地提出用核酸信号扩增代替PCR模板扩增来构建数字化核酸检测的新策略。在课题组前期建立的基于核酸侵入反应基因突变信号扩增检测方法的基础上，通过创建基于惯性微流控芯片的数字化检测反应单元制备新方法，获得大小均一且每个微液滴内含有单个微球的数字化检测反应单元，并发展能在固相微球表面进行核酸信号放大的低背景级联核酸侵入反应，实现在微反应单元内对单分子待测突变模板进行高灵敏、高特异信号扩增，通过建立微球通用荧光探针报告体系，采用流式细胞仪对反应得到的阳性微球与阴性微球进行计数，从而实现对待测基因突变靶标的信号扩增数字化检测，克服了数字化PCR易产生扩增产物交叉污染的问题，为发展基因突变数字化检测方法提供了新思路，为临床检测基因突变标志物提供了有力工具。

核酸检测技术在病原体防控、疾病诊断及精准药物治疗中均发挥着重要作用。数字化PCR技术是目前灵敏度最高、定量性能最好的核酸检测技术，常被用于微量基因突变检测中，在疾病诊断中应用广泛。然而，传统的数字化PCR技术由于采用模板扩增原理，其扩增产物极易引起交叉污染，造成假阳性的结果；此外，常规数字化PCR技术对扩增靶标的识别常采用水解荧光探针的方法，仅依靠探针与靶标杂交来区分野生与突变靶标，检测特异性还不够好。为了克服传统数字化PCR的上述问题，本课题将flap核酸内切酶催化的核酸侵入信号扩增反应引入到传统数字化PCR技术中，利用高特异的核酸侵入信号扩增反应来识别与报告扩增产物，使不增加反应单元的情况下，将传统数字化PCR检测基因突变的灵敏度提高了1000倍，实现了对低至0.0001%的单碱基基因突变靶标的高灵敏检测，并成功用于血液游离DNA中肿瘤相关基因突变的检测中。为了进一步消除传统数字化PCR易造成扩增产物交叉污染的难题，创新性地提出了基于发夹探针有限延伸的级联核酸侵入信号扩增反应，并据此建立了无需PCR扩增的核酸信号扩增数字化检测新方法，成功对肿瘤相关基因突变进行了检测。为了避免对荧光检测仪器的依赖，通过将核酸侵入信号扩增反应与纳米金探针杂交显色相偶联，建立了基于颜色编码的核酸可视化多重检测新方法与通用核酸检测试纸条，为发展核酸现场检测技术提供了新思路；在此基础上还发展了集样本提取、靶标扩增与检测于一体的卡盒式基因突变全自动检测技术，实现了“样本进-结果出”的基因检测，为核酸现场检测提供了新技术平台。相关研究内容共发表SCI论文13篇，其中影响因子大于10的1篇，大于5的7篇，申请发明专利2项。本课题建立的基于核酸侵入信号扩增反应的基因检测技术在病原体核酸检测、肿瘤相关基因突变检测中均具有非常广阔的应用前景。