微量体细胞突变体的核酸侵入可视化检测新方法研究

Somatic mutations are of important bio-markers for personalized medicine. However, detecting such mutations for population screening purposes presents a challenge for the clinical laboratory because of the large amount of wild-type DNA coexisting in clinical samples. Most methods developed for minority mutation detection require expensive instruments or fluorescent probes, which increase the cost of detection, and the sensitivity of the methods usually can not meet the requirement of clinical diagnosis..In this study, a novel colorimetric detection of minority somatic mutation without the use of any expensive instrument is proposed based on the invasive reaction combined with gold nanoparticle probes assembling. The mutant templates can be amplified from a large amount of wild type templates by invasive signal amplification, producing a large number of mutant template-specific flaps; then the flaps are transformed into other signal molecules, which can cause the aggregation of gold nanoparticle probes. If a mutant target presents in a specimen, the reaction buffer would show red color, and could be visualized with the naked eye. The specificity of the method is expected to achieve 1 mutant molecule in 1000 wild type molucles (0.1%). The proposed method can be used to detect the minority somatic mutations in clinical tumor samples (including puncture samples and paraffin tissues) to guide personalized medicine of tumor-targeted drugs. This study will provide a useful tool for detecting bio-markers related to personalized medicine.

体细胞基因突变是一种重要的个体化用药相关生物标志。但由于临床样本中含有大量的野生型DNA，检测其中微量的突变基因变得十分困难。现有基因突变检测方法存在灵敏度低、检测成本高、仪器设备昂贵等缺点，难以在临床中推广应用。本课题拟利用核酸侵入信号放大反应，从大量野生模板背景中高特异性地扩增微量突变模板，产生大量与突变体相对应的核酸片段（flap），再将该flap转化为能使纳米金探针聚集显色的信号分子。当样本中含有突变体靶标时，反应溶液呈现肉眼可见的红色。通过肉眼观察纳米金溶液颜色的变化判定样本中是否含有基因突变体,据此建立一种高灵敏、且无需昂贵设备、低成本的微量体细胞突变体可视化检测新方法。课题目标是使建立的方法能检测到样本中0.1%以下的基因突变，实现肿瘤样本（穿刺样本和组织切片）中微量基因突变体的检测，指导肿瘤靶向性药物的合理用药，为临床提供一种个体化用药相关标志物检测新工具。

基于纳米金探针的核酸可视化检测由于无需昂贵特殊设备而在分子诊断领域具有一定优势。然而，现有的基于纳米金探针的可视化核酸检测方法由于特异性不够好而难以检测体细胞突变。本项目利用核酸侵入反应的高特异性，将待测基因突变靶标转化为flap信号分子，然后将其作为其他核酸信号扩增检测的模板，成功建立了系列基因突变检测新方法。首先，利用连接反应成功将核酸侵入反应与切刻内切酶信号扩增反应相偶联，建立了级联酶促信号扩增检测基因突变检的方法，该方法可检测0.1%的基因突变，并实现了对临床实际样本的检测，然而，该方法步骤较多，操作繁琐。为了简化操作，将核酸侵入反应与链置换延伸信号扩增反应相结合，建立了核酸侵入反应偶联延伸置换反应的基因突变检测新方法。该方法检测灵敏度可达到0.2 pM，并能实现对单个碱基差异模板的检测，但是，仍需要荧光检测设备，无法实现可视化检测。为了建立可视化检测方法，将核酸侵入反应通过连接反应与切刻内切酶纳米金可视化检测反应相结合，建立了核酸侵入反应偶联纳米金可视化检测基因突变的新方法。该方法可实现肉眼可视化检测1%的基因突变，但其仍需进行连接反应，操作依然繁琐。为了建立简便的基因突变可视化检测方法，发展了级联核酸侵入反应偶联纳米金可视化检测新方法，该方法无需连接反应，仅需要在核酸侵入反应完成后加入纳米金探针进行杂交显色反应即可对0.05%的基因突变进行可视化检测，然而，该方法检测灵敏度仅为10 pM，难以实现直接检测实际样本中的微量突变。为此，利用硅烷化修饰的纳米金探针，克服了纳米金探针对酶促反应的抑制作用，并通过优化反应体系与条件，成功建立了将PCR扩增反应、级联核酸侵入反应及纳米金探针杂交显色反应在单管中依次进行的PCR扩增偶联纳米金颗粒的闭管可视化基因突变检测新方法，该方法只需加入待测模板就可在单管中通过肉眼检测0.1%的基因突变，其检测灵敏度能达到2.5 aM，可对肿瘤样本中的微量基因突变进行可视化检测。我们建立的系列基因突变检测新方法为高特异、高灵敏检测疾病相关核酸标志物提供了新思路与新途径。