禽呼肠孤病毒σA蛋白互作宿主蛋白的筛选及其功能的研究

Avian reovirus (ARV) is associated with a variety of disease conditions and immunosuppression in poultry that cause severe economic loss to the poultry industries across the globe. ARV S2 segment-encoded structural σA protein plays a key role in ARV pathogenesis. However, the interaction of σA protein and host proteins on regulation of ARV replication and apoptosis as well as host innate immune remain unclear. In this study, the regulation of σA protein on host innate immune will be investigated by determination of mRNA transcription levels of pattern recognition receptors, adaptor and effectors of host innate immune system. Host proteins interacted with σA protein will be screened by Yeast two-hybrid technique and identified by Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and GST-pulldown assays. The binding regions of σA protein and host proteins will be identified by Co-IP assays. The laser scanning confocal microscopy analysis will be performed to examine the co-localization of σA protein and host proteins in the cells. The roles of host proteins on ARV replication will be examined by siRNA interfere and over-expression methods. The roles of host proteins on apoptosis will be assessed by flow cytometry and western blotting. Analysis of interaction with host proteins on ARV replication and apoptosis. Therefore, these above investigations will be helpful to identify and assess the host innate immune system of σA protein and interaction with host proteins on ARV replication and apoptosis, and also will contribute to further clarify the pathogenesis mechanism of ARV.

禽呼肠孤病毒（ARV）可引起鸡多种疾患和免疫抑制，严重危害养禽业发展。σA蛋白是ARV的结构蛋白，在ARV致病过程中发挥重要作用。但是σA蛋白与宿主蛋白的相互作用，及它们对病毒复制、细胞凋亡和宿主天然免疫等的调控机制尚未清楚。本课题通过研究σA蛋白对宿主天然免疫应答模式识别受体和效应因子及相关信号通路的调控作用，分析σA蛋白对宿主天然免疫应答的调控机制。通过酵母双杂交、Co-IP和GST-pulldown等筛选和验证与σA蛋白互作的宿主蛋白，明确σA蛋白和互作蛋白的互作区域。采用激光共聚焦显微镜观察，明确σA蛋白和互作蛋白的细胞共定位。利用siRNA抑制、过表达、定量PCR和流式细胞术等方法，分析互作蛋白对ARV复制及细胞凋亡的调控作用。通过上述研究，阐明σA蛋白对宿主天然免疫应答的调控作用，揭示与σA蛋白互作宿主蛋白对ARV复制和细胞凋亡的调控机制，有助于进一步阐释ARV的分子致病机理。

研究表明，ARV感染和病毒编码σA蛋白都对宿主的天然免疫应答发挥重要作用，但尚不清楚σA蛋白通过何种分子调控机制影响天然免疫相关模式受体的识别及其效应因子的产生。病毒编码蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用在病毒感染、致病和宿主免疫应答过程中发挥重要作用，但ARV σA蛋白与哪些宿主细胞蛋白发生相互作用，这些互作蛋白又是如何影响ARV复制也还不清楚。. 本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞（DF1）后，不同时间点（3、6、9、12、24 、36和48h）DF1细胞中天然免疫相关基因，包括TLR3、TLR7、TLR15、MDA5、MyD88、MAVS、TRIF、IRF7、NF-κB、TRAF3、TRAF6、IKKƐ、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果表明，与σA的表达水平一致，转染后DF1细胞中TLR3、TLR7、MDA5、MAVS、MyD88、TRIF、IRF3/7、NF-κB、IKKe、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL的转录水平显著升高，并在不同时间达到高峰；相反，转染后大多数时间点，DF1细胞中的TRAF6和IFN-α/β均受到抑制，TLR15、TRAF3等基因表达无明显变化。. 通过酵母双杂交，筛选出可能与σA蛋白互作的4种细胞蛋白，包括初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白（GHP）和线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9)。 通过CO-IP 进一步确定了与σA蛋白互作的细胞蛋白为NME2。激光共聚焦试验证实，体外共转染σA和NME2 于DF-1细胞，二者共定位于胞浆中。在DF1细胞中过表达NME2基因，结果发现，过表达NME2基因，会抑制ARV感的复制。利用siRNA技术，对NME2基因进行沉默表达，结果发现，沉默NME2基因， ARV复制为对照组的2倍左右。通过截短表达，找出了σA与NME2基因互作的区域（NME2的121-416 位氨基酸，σA 的 71-139 位氨基酸）。