猪流行性腹泻病毒膜蛋白互作宿主细胞蛋白的筛选及功能研究

The M protein of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is one of three structural proteins on the viral envelope which plays roles in virus assembly process, subversion of innate immunity and influencing proliferation of host cells. However，which endogenous proteins does the M protein interact with to achieve its functions ? What other biological functions is the M protein responsible for beside the above functions? For answering these questions it is needed to know which host cell endogenous protein interacts with the M protein. Our purpose in this project is to identify the target protein interacting with PEDV M protein in IECs using Co-IP, mass spectrometry and an innovative protein labeling method based on peroxidase APEX2. RNAi will also be employed to validate the interactions of PEDV-M with target proteins and the functions of their interactions. The research results will provide hints for research on PEDV-host cell interactions.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）膜蛋白（M）是其囊膜上三种结构蛋白之一。具有组装病毒颗粒、抑制细胞的先天性免疫应答活性和抑制细胞分裂增殖的功能。然而，M蛋白这些功能是通过哪些细胞内源性蛋白实现的？M蛋白是否还有其他作用？这些问题的回答离不开对M蛋白与宿主细胞互作蛋白靶点的探明。本项目拟采用基于过氧化物酶APEX2的生物素化学标记法、免疫共沉淀和质谱分析鉴定IECs细胞中与PEDV-M蛋白相互作用的靶蛋白；再采用RNA干扰沉默这些靶点基因，在RNA和蛋白质水平上验证PEDV-M蛋白的作用，阐明PEDV-M蛋白与靶蛋白的作用机制。研究成果将为PEDV与细胞相互作用机制研究提供技术支撑。

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）膜蛋白（M）在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用，但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。本项目分别利用抗坏血酸过氧化酶 (APEX2) 活细胞内邻近标记技术和免疫共沉淀技术（Co-IP）结合液相串联质谱（LC-MS/MS）在猪小肠上皮细胞细胞（IPEC-J2）和Vero细胞内筛选与PEDV M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白，并基于生物信息学对鉴定到的细胞内源性蛋白进行分析，确定候选蛋白，通过免疫共沉淀（Co-IP）和共定位分析进行验证。利用siRNA干扰与M蛋白互作的细胞内源性蛋白的表达水平，研究M蛋白的互作蛋白对PEDV增殖的影响。. 通过本项目实施：① 运用APEX2邻近标记策略在IPEC-J2细胞内鉴定到41个（唯一肽段数≥2）与M蛋白有潜在相互作用的细胞内源性蛋白，且证实S100A11、NHE-RF1、CLDN4、RIG-I、PPID蛋白分别与M蛋白有稳定的相互作用。研究表明，APEX2活细胞内邻近标记策略可以用于研究病毒与宿主细胞的相互作用，为研究病毒与宿主的互作提供了一个可靠的方法。② 运用Co-IP方法在感染PEDV的Vero细胞中鉴定了218个与M蛋白有潜在相互作用的细胞内源性蛋白，分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关，且证实CDC42、Rab11a、eIF3L与M蛋白有稳定的相互作用。③ 证实eIF3L和PPID蛋白表达水平的降低，可以促进PEDV的增殖，表明eIF3L和PPID蛋白影响PEDV的增殖。. 上述研究成果具有重要的学术理论价值，为深入研究PEDV感染过程中M蛋白与宿主细胞蛋白互作机制提供了科研基础，也为APEX2邻近标记策略在病毒与宿主细胞的互作领域中的应用提供有力的技术支撑。