禽呼肠孤病毒蛋白启动PI3K/Akt信号途径抑制细胞凋亡的研究

禽呼肠孤病毒（ARV）在鸡群中感染率较高，是危害养鸡业发展的重要传染病。ARV感染早期激活了PI3K/Akt信号途径，抑制了细胞凋亡以有利于ARV能完成其复制周期，但ARV是通过其哪一个基因来启动PI3K/Akt信号途径还不清楚。病毒基因中的PXXP和YXXXM位点，是调节亚基p85的潜在结合位点，结合后能激活PI3K/Akt信号途径，因此本课题选取ARV中具有PXXP和YXXXM位点的μA、μB、σA、μNS和σNS基因作为研究对象，在细胞中分别表达这5个基因的野生型和突变型后，通过Western-blot和FCM技术检测pAkt的表达量，找出能激活PI3K/Akt信号途径抑制细胞凋亡的ARV基因，并确定其是否是通过PXXP或YXXXM位点与调节亚基p85结合来激活PI3K/Akt信号途径的。本课题的开展将从细胞信号转导角度揭示ARV的致病机制，也为寻找抗ARV药物作用靶点提供新的思路。

ARV感染Vero细胞后，可在感染的早期激活PI3K/Akt信号通路。ARV有15个编码蛋白， 但还不清楚ARV是通过哪一个蛋白来启动PI3K/Akt信号通路的。ARV 的σA、σNS、μA、μB和μNS这5个蛋白具有PXXP和YXXXM/YXXM基序（即潜在具有激活PI3K/Akt信号通路活性），因此本研究将这5个基因成功构建了重组质粒并转染Vero细胞，采用间接免疫荧光和Western blot检测目的蛋白的表达，并通过流式细胞术和Western-blot，检测转染后Vero细胞磷P-Akt的表达量。结果显示，5个目的蛋白均得到了表达。转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero 细胞，P-Akt 的表达量明显升高，而使用PI3K特异性抑制剂LY294002则能抑制P-Akt 的表达量明显升高。结果表明，ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活细胞的PI3K/Akt信号通路。. 为验证σA和σNS蛋白，是否是通过PXXP或YXXXM基序来激活PI3K/Akt信号通路的，本研究采用重叠延伸PCR的方法，将σA和σNS基因的PXXP或YXXXM基序进行突变后构建了重组质粒，并在Vero细胞中进行了表达。通过流氏细胞术和Western-blot，检测转染后Vero细胞P-Akt的表达量，并与野生型σA和σNS蛋白激活的P-Akt表达量进行比较。结果显示，σA和σNS基因均得到了表达，σA基因的110-114和114-117位的PXXP基序突变后， Vero 细胞P-Akt 的表达量明显下降。结果表明，ARV的σA蛋白，是通过PXXP基序来激活PI3K/Akt信号通路的。为验证ARV的σA和σNS蛋白，是否是通过与P85亚基结合来激活PI3K/Akt 信号通路的，本研究将重组质粒σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN转染VERO细胞，收集细胞裂解后用P85阳性血清进行免疫共沉淀。 western-blot检测结果显示，VERO细胞中σA和σNS蛋白的表达均为阳性，但P85蛋白未能把σA和σNS蛋白一起沉淀下来，推测σA和σNS蛋白与P85可能是瞬时结合，或者σA和σNS蛋白未与P85直接结合，可能通过中间蛋白与P85调节亚基作用。本研究从细胞信号转导角度揭示了ARV与宿主相互作用的机制，也为寻找抗ARV药物作用靶标提供了新的思路。