核磁共振分析设计蛋白的结构、动力学与相互作用

Structure and dynamics are fundamental to protein functions. Nuclear magnetic resonance (NMR) is one of the primary techniques to investigate protein structure and dynamics at the atomic level and has been widely used in studies of natural proteins. With the development of computational methods, de novo designed proteins show stable structures and interactions similar to natural proteins, while tend to exhibit distinct kinetic properties. Characterization of these designed proteins with NMR means may help us to understand protein structure-functional relationship from a new perspective. By comparison with natural proteins, we could explore how evolution affects protein dynamics during natural selection. We have successfully designed a number of proteins with stable structures and protein-protein interactions. Based on these previous work, we will acquire more artificial proteins with different structural stability and interaction affinity through sequence design and directional evolution. We will characterize their atomic-level structures and dynamics in detail with NMR to explore the relationships between sequence and function in comparisons with natural proteins. This study can provide a more comprehensive understanding of the role of protein dynamics in structure, function and evolution, which can guide functional protein design and directed evolution.

结构和动力学是蛋白质发挥功能的基础。核磁共振是在原子层次研究蛋白质结构和动力学的主要手段之一，已被广泛应用于研究天然蛋白质。由于计算方法发展，人工设计的蛋白也可以具有与天然蛋白类似的稳定结构和相互作用等功能，但它们往往表现出与天然蛋白截然不同的动力学特性。用核磁共振分析人工设计蛋白，可以从新的视角来分析蛋白质结构、动力学和功能关系；通过与天然蛋白对照，可探索进化在蛋白质获得其动力学特性中的作用。此前，我们成功设计了若干具有稳定结构以及具有蛋白-蛋白相互作用功能的人工蛋白。在此基础上，我们将通过序列重设计、定向进化等获得具有不同结构稳定性、不同相互作用强度的人工蛋白，用核磁共振全面表征它们原子层次的结构和动力学，分析其与序列和相互作用的关系，并与相应天然蛋白比较，由此对动力学在蛋白质结构功能及其进化中的作用获得更全面的认识，并为相互作用等功能蛋白质的设计、定向进化等提供指导。

蛋白质序列从头设计基于的统计能量函数打分是以蛋白质的最佳折叠稳定性为目标，导致人工设计蛋白表现出不同于天然蛋白的结构动力学特性，如折叠速率更快、稳定性更高、不具有折叠协同性等。通过核磁共振等手段分析人工设计蛋白，可以从新的视角来分析蛋白质序列、结构和功能关系，为功能蛋白设计提供指导。本项目完成的工作主要包括：1)设计了若干个仅在相互作用界面上与天然蛋白一致、其他部分重新设计的人工Ras结合蛋白。胞内和胞外实验均证明人工蛋白能与Ras特异性结合，并具有超高热稳定性。2)通过核磁共振结构解析和化学位移扰动实验，证明了dRafX6在三维结构和相互作用方式上与天然蛋白高度一致。3)通过对dRafX6与Raf-RBD的突变体热稳定性对比，分析dRafX6高热稳定性的机理。在不同的序列环境中，设计蛋白热稳定性的显著提高具有明显的上位效应，而在相同的序列环境中，上位效应较弱。验证了蛋白质从头设计策略在提高热稳定性方面的独特优势。4)通过对相互作用界面残基的定向进化，获得高亲和力和稳定性的dRafX6突变体。5)基于DsbA折叠性筛选平台对人工设计蛋白E_1r26进行折叠协同性演化，在维持基本结构稳定性的同时，人工设计蛋白突变体E_1r26 108在稳定性和折叠协同性上表现出与天然蛋白质相似的热力学特征，表明蛋白质的协同性并非蛋白质稳定性与功能的必要条件，而是自然选择的结果。此外，我们还改进完善了全自动蛋白质序列设计ABACUS，改进后的ABACUS2在准确度和计算效率方面都有显著提高。综上，我们通过对一系列相互作用强度不同、结构稳定性不同的人工设计蛋白及其突变体的结构、功能和热力学表征，为分析蛋白质结构和功能关系提供了基础。