通过从头设计构象多样性实现蛋白-蛋白相互作用的定向进化

For many proteins, their three dimensional conformations are neither unique nor completely random. Instead, they change dynamically between different ordered conformational states. Some natural or designed proteins present stable, distinctive conformations upon small changes of environments or of amino acid sequences. Such conformational diversity is believed to be important for protein evolvability, by which proteins develop new structures and functions through sequence mutations. On the other hand, how to engineer proteins with novel structures and functions is an important but difficult subject of protein engineering. We have previously found that proteins designed de novo with a statistical energy function can be of conformational diversity. Built on this progress, the proposed research will develop computational methods that design conformational diversity on purpose. The designs will be verified with an efficient in vivo experimental approach. From sequences designed to have desired conformational diversity and thus strong evolutionary potentials, directed evolution with an in vivo protein complementarity analysis approach will be employed to engineer artificial proteins that can interact with selected protein targets. Further analysis will be carried out to understand the sequence and structure dependence of the engineered interactions. This research can deepen our understanding of protein conformational diversity in terms of its dependences on sequence and structure, its potential roles in the evolution of functions such as new protein-protein interactions. The research also aims at providing new strategies and methods for the rational design and directed evolution of novel protein functions.

很多蛋白质的空间构象既不是唯一确定的，也非随机的无规卷曲，而是在不同有序状态之间动态变化；此外，一些天然或设计蛋白在环境改变或氨基酸序列细微改变时能呈现截然不同的稳定构象。类似构象多样性被认为赋予蛋白质通过突变产生新结构和功能的进化能力。另一方面，在蛋白质工程研究中，如何获得有新结构和功能的蛋白是重要但十分困难的课题。我们前期发现用统计能量函数从头设计的序列可呈现出构象多样性。本项目将在此基础上，发展主动设计蛋白质构象多样性的计算方法，并采用高效的在体实验方法进行检验；将从通过构象多样性获得恰当进化潜力的设计序列出发，采用蛋白互补分析的在体定向进化方法获得新的、能够与靶蛋白相互作用的人工蛋白，进一步分析其与靶蛋白相互作用的序列、结构基础。项目通过具体实例深入认识构象多样性的序列结构基础、对蛋白-蛋白相互作用等功能进化的可能意义，并为人工设计与定向进化蛋白质功能提供新思路与方法。

本项目利用人工设计蛋白质研究蛋白质序列与结构的关系，并探索基于构象多样性和相互作用的蛋白质设计，主要完成了以下几方面的工作：1）通过晶体结构解析，验证了以全螺旋束的death domain主链结构为目标结构，用未专门考虑侧链堆积的统计能量模型设计的序列，其实际结构仍然与设计模板高度一致。由于前期工作中只解析了部分设计蛋白的溶液核磁结构，该结果直接、充分证明用ABACUS设计的人工序列可自发折叠成目标结构；此外, 我们用实验解析的death domain蛋白的两种构象态为共同目标结构，设计了可能具有多样构象的序列，完成了蛋白质表达、纯化和生物物理性质分析，但目前证据尚不能证明这些蛋白明确具有预期的稳定/亚稳定构象，提示用同时考虑多个目标结构的方法设计构象多样蛋白的现有方案可能还过于简单，今后需要进一步探索新的设计方法。2）建立了构象多样的蛋白质功能（蛋白-蛋白相互作用）鉴定筛选平台。基于天然Ras-Raf复合物结构，设计了若干个仅在相互作用界面上与天然蛋白一致、其他部分重新设计的人工Ras结合蛋白。胞内和胞外实验均证明人工蛋白能与Ras特异性结合，并具有超高热稳定性。该结果表明尽管从头设计蛋白在结构稳定性、构象动力学方面与天然蛋白可能有区别，但这些区别并不妨碍它们通过特异性相互作用发挥功能。3）分析了前一版ABACUS方法以硫氧还蛋白目标结构的序列设计未完全达成预期结果的可能原因，用据此改进后的算法对同一目标结构重新设计，溶液核磁结构解析验证了设计蛋白折叠成目标结构；此外，通过有约束的随机突变对稳定性反向演化，增加构象多样的可能性，得到了三维结构完整、稳定性降低至更接近天然硫氧环蛋白的设计蛋白突变体，并解析了突变体晶体结构，表明人工设计蛋白的演化可模拟天然蛋白的进化适应过程。同时我们还对具有构象多样性潜力的TIM蛋白进行模块拼接和定向进化，获得了热稳定性显著提高的突变体。我们预期，成功率更高、适用性更广的ABACUS蛋白质设计方法在后续研究中将具有重要价值。