基于人工TALE核酸酶的抗双生病毒研究

Geminiviruses have emerged as the most destructive plant viruses in the world and caused devastating diseases of economically important crops such as tomato, tobacco and cotton plants in China. So far, few efficient chemicals or resistant cultivars are available for controlling geminivirus diseases. Research projects aiming to eradicate the harm of this virus have been underway. Therefore, the focus of this study is on the use of engineered TALE nucleasesto specifically target the genomes of 3 model geminiviruses. EMSA, in vitro cleavage assay and agrobacterium-mediated transient expression assays in tobacco leaves will be performed to select TALE nucleases with DNA binding specificity and nuclease activity in vitro and in vivo to the selected geminiviruses. Additional pathogenicity tests will be used to determine the efficiency of TALE nuclease in inhibiting or interfering the replication of the geminiviruses in T0 generation of transgenic tomato plants expressing TALE nuclease. To our knowledge, this is the first test using designed TALE nucleases to prevent geminivirus infection. Accomplishments of this project will provide valuable information to the future work of producing virus-resistant crops and thus are of great academic and economic values.

双生病毒在世界范围内的危害日益猖獗，已给我国的番茄、烟草和棉花等多种重要经济作物造成毁灭性危害，而目前生产上还缺乏有效的化学药剂和抗病品种来控制该病害。本项目紧跟2011年国际生物技术研究领域的热点- - 基于TALE的新型基因打靶技术，以威胁我国整个番茄产业发展的3种重要双生病毒作为切入口开展相关研究。拟在生物信息学分析的基础上人工合成针对双生病毒的TALE核酸酶，利用凝胶阻滞实验(EMSA)、体外切割、农杆菌瞬时表达等实验筛选获得具有在寄主植物体内特异切割双生病毒基因组活性的TALE核酸酶，并在此基础上通过转基因技术和致病性测定获得能阻止或干扰双生病毒复制的T0代转基因植物。本研究可以填补相关研究领域的空白，具有重要的理论意义；另一方面可以获得具有自主知识产权和潜在商业应用价值的抗双生病毒分子育种的材料。

双生病毒是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒，已给我国的番茄、烟草和棉花等多种重要经济作物造成毁灭性危害。在本项目的资助下，我们针对生产上还缺乏有效的抗病毒化学试剂和抗病品种等缺陷，探索并建立了一套利用类转录激活因子（Transcription-like effector, TALE）进行抗双生病毒研究的体系和平台。在生物信息学分析的基础上，设计并组装了多种特异识别番茄黄曲叶病毒、甘蓝曲叶病毒以及潜在的能够识别多种双生病毒的人工TALE。通过比较带有不同融合标签的表达载体和表达菌株，建立和优化了TALE的原核表达体系，获得了纯化的TALE蛋白。利用凝胶阻滞试验分析人工TALE蛋白与病毒靶序列结合的能力，获得了3种能够体外结合双生病毒靶标序列的TALE。利用农杆菌接种和Western blot等试验发现发现人工TALE蛋白能够在植物中表达，且TALE的表达能够影响双生病毒DNA的积累。进一步将人工TALE转化烟草并对其抗病性进行测定，发现转基因植物延迟发病，而且会降低双生病毒DNA在植物中的积累量。我们的结果表明，人工TALE对双生病毒具有一定的抗性，可望作为抗双生病毒研究的一类重要手段。