放线菌沉默杀虫基因簇的筛选及其调控途径和功能产物作用机制

生物农药在我国具有潜在的巨大的市场。放线菌作为一类重要的微生物资源，在寻找和发现下一代生物农药中起着不可替代的作用。已有研究表明放线菌基因组中，除了合成已知活性产物(聚酮类化合物)的相关基因(簇)外，还有许多潜在的合成新的活性代谢产物核糖体合成的基因簇和非核糖体多肽生物合成酶基因簇，但由于种种原因他们处于沉默状态。本项目利用生物信息学软件从放线菌基因组信息库中搜寻能合成新的具有杀虫活性产物的沉默基因簇；利用Red/ET同源重组技术和通过建立基因组文库，将扫描获得的杀虫功能基因簇克隆并使其高效表达；对其代谢产物进行生物活性高通量筛选及其作用分子机理研究，获得半致死浓度和杀虫谱等信息；采用基因阻断、蛋白质双向电泳、放射性同位素标记、液-质分析、免疫共沉淀、RT-PCR和核磁共振分析等前沿技术，研究放线菌新的杀虫活性物质合成的代谢调控网络途径，通过操作代谢途径提高代谢产物使其变得可能。

放线菌作为一类重要的微生物资源，在寻找和发现新的杀虫药物分子中起着不可替代的作用。放线菌基因组中，除了合成已知活性产物的相关基因簇外，还存在许多处于沉默状态的合成新活性代谢产物的基因簇。本项目采用生物信息学、蛋白质组学、核糖体工程及Red/ET同源重组技术等方法对放线菌中的沉默基因簇进行了挖掘及其相关调控功能基因（簇）进行了研究，获得了重要进展。（1）利用生物信息学软件从放线菌基因组信息库中搜寻新的具有杀虫活性的产物，采用蛋白质组学与2-D LC-MS/MS技术对刺糖多孢菌多杀菌素菌株和原始菌株的蛋白质组进行比较，发现了12个与多杀菌素的生物合成直接相关的蛋白；对刺糖多孢菌四个不同生长时期的蛋白质组进行分析，构建了刺糖多孢菌蛋白质组数据库。（2）克隆了对抗生素生物合成起正调控作用的功能蛋白基因14个，并将其整合至刺糖多孢菌等放线菌染色体上，获得刺糖多孢菌重组工程菌株2株。研究了这些功能基因的表达对放线菌次级代谢的调控作用及在抗生素生物合成中的调控与修饰机制。（3）克隆了放线菌中对次级代谢产物合成起负调控作用基因relA、ppK 的部分基因，获得刺糖多孢菌阻断工程菌株2株。其中阻断菌株SP-relA与其出发菌株相比，在生长后期产生一种红褐色物质，说明relA基因的阻断可能触发了刺糖多孢菌体内的某些次级代谢沉默基因簇。（4）采用核糖体工程技术，对放线菌进行菌株选育和改良，获得4株杀虫活性提高的突变株。对突变株进行 DNA 序列分析，在编码核糖体S12蛋白的rpsL基因保守区域中发现了点突变。（5）利用课题组成员发明的Red/ET直接克隆技术和ccdB反向筛选，对放线菌基因簇进行克隆研究，获得了一种目标基因高效重组修饰技术 ，建立了放线菌基因簇研究的高效遗传修饰平台。首次对转座子和位点特异性重组系统在刺糖多孢菌遗传修饰中的应用进行了探索，促进了刺糖多孢菌的基因工程技术研究。在鉴定转座子插入位点的过程中，发明了一种名为SPTA-PCR的染色体步移方法。（6）优化了放线菌次级代谢产物多杀菌素的发酵条件，采用离子交换树脂对放线菌发酵浸提液的脱色技术进行了研究，效果良好。（7）发现一株对棉铃虫杀虫效果很好的放线菌新菌株，对该菌杀虫活性产物进行了功能测定、分离纯化和分子结构分析。。