基于单细胞拉曼-重水标记的环境抗生素抗性菌识别和抗性产生过程研究

Antibiotic resistance is a global public health concern. Environment is a huge reservoir of antibiotic resistance including both antibiotic resistant bacteria (ARB) and resistance genes (ARGs). However, the presence of environmental ARB which is a dominant role in endangering health and spreading antibiotic resistance, remains elusive due to that the vast majority of the microbes in the environment are uncultured. To address this issue, we will utilize a new method by combining single-cell Raman with heavy water labelling to identify ARB in complex environments including river and soil on the single-cell level accurately and rapidly. The abundance, distribution of ARB in environment and the correlation with the level of ARGs will be revealed. We will further apply this method to address another important issue of how environmental pollutants like antibiotics and heavy metals induce the antibiotic resistance in the environment, based on its three advantages of single-cell level characterization of bacterial heterogeneity, identification of active bacteria and rich Raman fingerprint information. By investigating the heterogeneous stress responses of antibiotic susceptible bacteria to typical environmental pollutants like antibiotics and heavy metal on single-cell level, especially the phenotypic response of the subpopulation of bacteria that survive antibiotic treatment, i.e. persistent or resistant cells, we will reveal the evolution process of antibiotic persistence or resistance, and the correlation with pollutant type, exposure dose and time. This study will provide a new means for recognizing ARB and the evolution of antibiotic resistance occurring in the environment in close contact with human being, and thus promote the comprehensive understanding of environmental antibiotic resistance.

抗生素抗性是全球面临的公共卫生问题。环境是抗生素抗性（抗性菌和抗性基因）的巨大储库，其中抗性菌是威胁健康并导致抗性传播的主要因素，然而由于环境微生物绝大部分不可纯培养，环境抗生素抗性菌的存在情况仍不清楚。为此，我们将创新性地利用单细胞拉曼-重水同位素标记联用技术，在单细胞水平上实现复杂水体和土壤环境中抗生素抗性菌的快速准确识别，并探明其丰度、分布、以及与抗性基因水平的相关性。在此基础上，进一步利用拉曼-重水标记技术在单细胞水平异质性表征、活性菌识别、丰富指纹图谱的优势，针对环境污染物（抗生素和重金属）诱导抗生素抗性这一重要问题开展研究。通过考察抗生素敏感菌在环境污染物胁迫下，产生耐受性或抗性的部分活性菌的特征表型响应，探明耐受性或抗性的产生过程，以及与污染类型和胁迫条件的关系。本研究将为认知与人类密切接触环境中的抗生素抗性菌和解析抗性诱导过程提供新的手段，促进环境抗生素抗性的深入认知。

环境是抗生素抗性的巨大储库。抗性菌是威胁健康并导致抗性传播的主要因素，然而由于环境微生物绝大部分不可纯培养，环境抗生素抗性菌的存在情况和进化机制仍不清楚。为此，我们建立了单细胞拉曼-重水同位素标记识别抗生素抗性菌和敏感菌的新方法。通过优化抗生素剂量，孵育时间，并建立拉曼判别标准，对14种不同病原菌对7种不同作用机制抗生素的药敏性进行了成功验证，获得了与临床标准方法一致的结果，证明了方法的可靠性。由于重水标记快速的特点，我们进一步将该方法拓展至临床尿液样品病原菌的快速药敏检测，检测时间仅为标准方法的1/10，为指导抗生素精准用药，遏制抗性传播，提供先进手段。在此基础上，利用单细胞拉曼克服培养限制的优势，我们将该方法用于水体、土壤、塑料际、鸡粪等多种不同环境介质中抗生素抗性菌的识别，阐明了多种重要临床抗生素（美罗培南、环丙沙星、头孢拉定等）抗性菌的环境丰度，证明了其环境广泛存在，并且随人为活动如粪肥施入而增加。另外，针对广受关注的塑料污染，我们揭示出塑料际的微生物对抗生素的耐受水平高于浮游细菌，证明其更大的潜在生态风险。相比于基因型水平，抗性表型菌群的丰度更有利于反映环境中真实的抗生素抗性水平。为此，我们提出了将环境表型抗性水平纳入环境抗性风险评估的必要性。最后，利用拉曼-重水标记技术在单细胞水平异质性表征、活性菌识别、丰富指纹图谱的优势，结合基因突变分析，研究了环境抗生素污染物（氨苄西林）诱导抗生素抗性的进化过程。研究揭示了进化过程中细菌对抗生素耐受性升高的过程以及高度异质性，准确识别出了其中少数的高活性耐受菌亚群，通过进一步考察不同活性亚群的拉曼指纹图谱变化，揭示出其对抗生素的不同表型响应，反映出细菌适应进化的对冲策略。上述研究为认知与人类密切接触环境中的抗生素抗性菌及抗性诱导过程提供新的手段，促进环境抗生素抗性的深入认知，为环境抗性风险评价提供重要指标。