基于单细胞拉曼-15N2稳定同位素标记解析水圈固氮微生物及其固氮活性

Biological nitrogen fixation (BNF) is the process whereby atmospheric nitrogen is reduced to bioavailable ammonium by diazotrophs. BNF provide the major source of new N input to hydrosphere, particularly of oceans, regulate its primary production and nitrogen balance. However, because a large portion of diazotrophs in ocean are yet unculturable, many questions regarding what the major N2-fixing organisms are, how the N2 fixation rates are and what controls their distributions, remain unclear. New technologies bring new discoveries. Therefore, we will develop single-cell Raman spectroscopy coupled with 15N2 stable isotope probing (Raman-15N2 SIP) to study diazotroph in a culture-independent way. Considering the important contribution of autotrophic cyanobacterial diazotroph to N2 fixation in hydrosphere, 15N-induced Raman band shift specifically indicating N2 fixation in cyanobacteria will be explored. Together with our previous findings of indicator band for heterotrophic diazotroph in soil, single-cell Raman 15N2 will be developed as a universal method applicable to diverse diazotrophs in diverse habitats. Targeting the important ocean containing a large quantity of unculturable bacteria, single-cell Raman 15N2 SIP will be applied to detect diazotroph including important cyanobacteria with relatively high N2 fixation rate based on specific 15N-induced band shift and shifting extent. This high resolution single-cell approach will be also used to study N2-fixing activity of heterocyst in filamentous cyanobacteria. Furthermore, Raman-activated single-cell sorting based on laser ejection will be employed to sort out single diazotroph with high N2-fixation rate for downstream single-cell whole genome amplification and sequencing. N2-fixation phenotype and genotype will be well linked, enabling the exploration of novel N2-fixing species and novel functional genes in ocean. These studies will greatly promote our understanding of nitrogen cycle, especially N2 fixation in hydrosphere.

生物固氮，是指微生物将氮气还原成生物可利用氨的过程。生物固氮是水圈环境，尤其是海洋中“新氮”的主要来源，调控其初级生产力并影响氮储库的收支平衡。然而，由于海洋中大部分固氮微生物不可纯培养，固氮微生物组成、活性和机制等信息仍非常不明确。为此，我们将发展不依赖纯培养的单细胞拉曼与15N2稳定同位素标记联用技术，基于对异养固氮菌的研究基础，进一步聚焦对水圈固氮起主要贡献的自养固氮蓝藻，挖掘15N2同化引起的固氮蓝藻的特征拉曼峰，拓宽单细胞拉曼-15N2方法至固氮蓝藻，实现在不依赖纯培养的条件下，检测海洋中的固氮微生物及其活性，探明具有高固氮活性的微生物，并利用方法单细胞水平的高空间分辨率，考察固氮异形胞的固氮活性。在此基础上，借助单细胞分选和测序，建立固氮微生物功能表型和基因型的联系，探索新型固氮物种和固氮基因，促进对水圈氮循环过程的深入认识。

固氮蓝藻在驱动全球水圈碳氮元素循环中起着至关重要的作用。由于兼具固氮和固碳能力，固氮蓝藻与生态系统中的多种生物存在广泛和活跃的营养互作。然而，由于水圈大部分固氮微生物不可纯培养，以及原位研究手段的缺乏，原位监测固氮微生物在环境中的固氮固碳活性，以及与其他生物的互作仍面临很大挑战。.针对这些挑战，本项目基于单细胞拉曼光谱，结合15N和13C稳定同位素标记，并开发适于拉曼原位研究的微流控技术，建立了在单细胞水平原位跟踪活体蓝藻C/N固定活性、细胞间C/N元素交换、以及生理变化的新方法。我们以模式和水华固氮蓝藻为研究对象，在优化条件获得高质量拉曼谱图的基础上，结合15N2/13CO2稳定同位素标记,并经同位素质谱进行验证，首次发掘出可指示蓝藻C/N固定及活性的拉曼标志峰，实现了单细胞水平识别并定量蓝藻功能活性。在此基础上，发展出可在原位培养过程中，对固氮蓝藻进行实时拉曼检测的拉曼-微流控培养芯片（RMCS），结合拉曼标志峰和拉曼成像技术，同时解析元素的时空变化，实现了异形胞和营养细胞C/N固定和双向交换的原位实时追踪，并计算出了单细胞水平的元素固定和迁移速率。进一步，利用该RMCS和拉曼光谱可反映细胞表型组的信息，原位研究了氮素增加条件下，固氮蓝藻的生理变化。另外，我们也利用所发展的单细胞拉曼-15N2技术，在内蒙古地下水样品中发现了具有固氮活性的细菌。在此基础上，搭建了激光弹射单细胞拉曼分选和扩增平台，对拉曼识别的环境固氮菌进行了分选和测序，确定了其种属，并利用该拉曼分选平台，对印度洋热液口的光合菌进行了研究，发现了一株新型光合细菌，并确定了所携带的光合基因簇。.上述工作实现了单细胞水平上原位跟踪活体细胞间的营养互作、元素交换和生理变化，并将方法用于不同水圈环境的功能菌，在方法学上具有显著进步。该工作也为原位研究其他环境，以及固氮微生物与其他物种之间的元素交换，进而为深入认识生态系统的建立和稳定，提供先进技术手段。